大鼠斑蝥酊天灸发泡的影响因素探讨

肖双凯,张江松,焦俊玥,赵逸彬,林咸明



大鼠斑蝥酊天灸发泡的影响因素探讨

肖双凯,张江松,焦俊玥,赵逸彬,林咸明

(浙江中医药大学,杭州 310053)

探讨大鼠斑蝥酊天灸发泡的相关影响因素。采用斑蝥酊刺激大鼠皮肤,观察并统计斑蝥酊药物浓度、药物剂量、斑蝥酊贴药时间、贴药后是否加压、是否重复加药、大鼠发泡部位、室温等方面的差异性。5% 200mL的斑蝥酊贴敷于SD大鼠项部两耳后脊柱两旁区域,并在2 h后重复给药200mL 1次, 4 h后可以实现稳定的天灸发泡。大鼠天灸稳定发泡的影响因素以人为因素为主,包括药物浓度、发泡部位、斑蝥酊贴药时间、是否重复加药、室温。控制好人为因素可以提高SD大鼠天灸发泡模型制备的成功率和稳定性。

发泡疗法;灸法;斑蝥酊;大鼠

天灸是采用刺激性较强的中药贴敷在皮肤特定穴位,使局部发热、充血、发红、发泡甚至化脓的一种外治方法[1]。目前,国内外关于天灸的动物实验和临床研究均因缺乏稳定的大鼠天灸发泡模型而受到限制。斑蝥是天灸临床和实验中常用的发泡药物,相对于传统的白芥子发泡具有一定的优势[2]。笔者通过对斑蝥剂型的改良,不断尝试,终于探索出了一种稳定的大鼠天灸发泡方法。同时,笔者经过前期大量预实验和查阅文献,发现影响大鼠斑蝥酊天灸发泡的因素主要以人为因素为主,包括斑蝥酊药物浓度、药物剂量、贴药时间、是否重复加药、发泡部位及室温等。为了提高该模型制备的成功率和稳定性,本文从这些方面进行展开,以期为天灸的实验研究提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物与预处理

选用健康雄性清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠,体重为(250±10)g,购自浙江省实验动物中心(许可证号SCXK浙2014-0001),由浙江中医药大学实验动物中心饲养。饲养期间给予啮齿类动物标准颗粒饲料及自由饮水。实验过程中对动物的处置符合《关于善待实验动物的指导性意见》[3]中相关规定。

实验前应进行大鼠发泡区域的备皮。大鼠腹腔麻醉后,于项部两耳后脊柱两旁(相当于大椎穴处)等距离、等面积用薇婷脱毛膏脱毛4 cm2,用生理盐水清洁,室温控制在26℃,大鼠于恒温台上安置。

1.2 实验试剂与药物

斑蝥粉(华东医药公司,批号100722);95%乙醇(上海展云化工有限公司,批号20140412);5 cm×5 cm内圈1 cm新型PU防水空白膏药贴(连云港三瑞医疗器械制造有限公司);PU防水膜(连云港三瑞医疗器械制造有限公司);薇婷脱毛膏(利洁时家化有限公司)。

1.3 斑蝥酊的配制及发泡药贴的准备

1.3.1 斑蝥酊的配制

分别用5 g、10 g、20 g、30 g的生药斑蝥粉浸泡于95%乙醇中,定容至100 mL,1周后过滤而成,放置在4℃冰箱保存,从而得到不同浓度的斑蝥酊,即5%斑蝥酊、10%斑蝥酊、20%斑蝥酊、30%斑蝥酊。

1.3.2 发泡药贴的准备

称取0.018 g棉球填充于PU防水空白膏药贴的中央,轻轻按压,以棉球刚好填充满并且不高突于发泡药贴的中心圈为度。

1.4 实验方法

1.4.1 天灸发泡方法

上述准备工作完成后,用移液枪吸取200mL斑蝥酊均匀浸湿发泡药贴中心棉球后,贴敷于大鼠待发泡区域。发泡药贴四周贴膜应当均匀,防止药物挥发。2 h后加200mL斑蝥酊1次,用PU防水膜密封覆盖,每隔1 h观察并记录1次。待泡体大小不再继续增加,立即收集泡液。从中间区域剪下PU防水膜,镊子夹出棉球并沿着发泡药贴的内侧缘提起,观察发泡情况。大鼠于恒温台上安置,待苏醒后单笼饲养,每日观察1～2次。

1.4.2 相关影响因素

1.4.2.1 不同斑蝥酊药物浓度

32只雄性SD大鼠麻醉、脱毛后,吸取200mL 4种浓度(5%斑蝥酊、10%斑蝥酊、20%斑蝥酊、30%斑蝥酊)的斑蝥酊均匀浸湿发泡药贴中央棉球后,贴敷刺激。2 h后各加200mL相应浓度的斑蝥酊1次,密封覆盖,4 h后统一收集泡液。观察各组发泡率和泡体大小情况,从而筛选出影响发泡率的最佳斑蝥酊浓度。同时,每隔1 h观察发泡情况,并详细记录,以明确不同贴药时间对发泡的影响。其他条件均控制相同。

1.4.2.2 药物剂量

48只雄性SD大鼠麻醉、脱毛后,按照上述浓度随机分为4组(5%斑蝥酊、10%斑蝥酊、20%斑蝥酊、30%斑蝥酊),每组12只。每组按照不同剂量又分为3组,即低剂量(50mL)4只、中等剂量(100mL)4只和最大剂量(200mL)4只。分别吸取不同剂量、不同浓度的斑蝥酊均匀浸湿发泡药贴中央棉球后,贴敷刺激。其他方法同上,2 h后同样各加相应剂量、相应浓度的斑蝥酊1次,观察各组发泡率情况,从而筛选出影响发泡的最佳斑蝥酊剂量。其他条件均控制相同。

1.4.2.3 重复给药

选用16只雄性SD大鼠,分为单次给药组与重复给药组,每组8只。单次给药组只在初次给予5%斑蝥酊刺激,后续不重复给药;重复给药组在初次给予5%斑蝥酊刺激后的2 h,重复给药1次。观察重复给药与否对于斑蝥酊天灸发泡的影响。其他条件均控制相同。

1.4.3 贴药时间

据上述方法筛选出斑蝥酊最佳浓度和剂量之后,以此观察不同贴药时间组(2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h)大鼠发泡泡体大小的变化,每组8只,从而选出最佳收取泡液的时间点。

1.4.4 发泡部位

选取15只SD大鼠,分为3组,分别取背部3处部位发泡,即大椎穴处、背部正中线处和背部中线两侧0.5 cm处,每组5只。发泡方法同上所述,2 h后需重复给药1次。大鼠大椎穴定位参照《实验针灸学》[4]中大鼠标准穴位图谱定位及部分相关文献[5]。其他条件均控制相同。观察不同部位对大鼠天灸发泡的影响。

1.4.5 室温

选取15只SD大鼠,分别在不同室温条件下适应性喂养3 d,然后进行天灸发泡,分为根据不同室温[较低温度(16℃)、适宜温度(26℃)和高温(36℃)]分为3组,每组5只。其他条件均控制相同。观察不同室温环境对大鼠天灸发泡的影响。

1.5 统计学方法

所有数据采用SPSS19.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示。多组间比较时,若方差齐采用单因素方差分析()-检验,方差不齐则用’-检验;组内前后比较采用重复测量资料的方差分析。以＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

因大鼠和人皮肤的差异性,目前尚无详细的实验性大鼠天灸发泡的文献报道,笔者经过多次反复实验,发现泡体大小尚无法人为控制,最小可如粟米般,最大者可充满整个发泡药贴,泡体大小暂无明确的分类标准,需要进一步大样本实验进行重复验证、归类。故笔者暂拟以出现泡体即可作为发泡成功的标准。

2.1 不同斑蝥酊药物浓度对发泡率以及泡体大小的影响

各组大鼠都有不同程度的发泡,低浓度组(5%斑蝥酊组和10%斑蝥酊组)发泡率整体高于高浓度组(20%斑蝥酊组和30%斑蝥酊组);低浓度组中5%斑蝥酊发泡率为87.5%,高于10%斑蝥酊组的75.0%;高浓度组中,20%斑蝥酊组发泡率和30%斑蝥酊组相同,均为62.5%。低浓度组发泡率高于高浓度组,尤其以5%斑蝥酊组成功发泡数最多,发泡率最高。提示斑蝥酊浓度因素对发泡有一定的影响,但不是决定性因素。实验观察到高浓度组极易出现烫伤样疤痕,大鼠一般情况较差,低浓度组为更适合斑蝥酊天灸的浓度选择。详见表1。

表1 各组大鼠发泡率及泡体大小比较

2.2 药物剂量对发泡的影响

本研究所选用的PU防水空白膏药贴中心棉团的最大载药量为200mL,若继续加大给药量,则发泡区域会全部被药物浸湿,四周也会渗透蔓延,直接影响到发泡效果,对大鼠刺激性太强,故把200mL定义为最大斑蝥酊剂量。其次,设定梯度浓度,最小给药剂量为 50mL,此时中心棉团只有小部分浸湿;中等给药剂量为100mL,此时中心棉团大部分区域均浸湿,但并不充分。笔者发现不同斑蝥酊剂量对大鼠发泡有明显影响,突出表现在各组给药50mL时均不发泡;给药100mL时,低浓度组(5%斑蝥酊组和10%斑蝥酊组)偶见少量发泡;给药200mL时,低浓度组发泡普遍,均高于高浓度组。并且在低浓度组中,5%斑蝥酊组发泡效果始终高于10%斑蝥酊组,故笔者认为5% 200mL斑蝥酊是最适宜发泡的浓度和剂量,同时也观察到结痂和剂量有直接关系,而与浓度关系不大,给药200mL的各组均出现不同程度的结痂,但是给药50mL和100mL各组均无结痂出现。详见表2。

表2 各组同一部位不同斑蝥酊剂量发泡率比较 (只)

2.3 斑蝥酊贴药时间对发泡的影响

在筛选出5% 200mL斑蝥酊后,笔者以此浓度和剂量观察不同贴药时间对发泡的影响,结果发现天灸1～2 h时,各组大鼠均无发泡。天灸3 h后,逐渐有少量大鼠天灸区域起泡。4 h是一个很重要的时间节点,天灸4 h前,大鼠只有少部分发泡或不发泡;天灸4 h后,大鼠普遍有发泡,且随时间的增加,发泡泡体不会继续增大。部分大鼠在原有泡体周围,还有1～2处新增泡体出现。天灸24 h前后,泡液几乎完全消失。故本研究以4 h作为统一收集泡液的时间点。详见表3。

2.4 是否重复给药对发泡的影响

对于重复加药方法的确定,本研究发现单纯1次给于200mL的5%斑蝥酊并不能发泡,这可能是由于斑蝥酊经过皮肤渗透逐渐吸收之后,发泡药贴中心棉团逐渐干燥,剩余斑蝥酊剂量不足,不能起到持续性的皮肤表面刺激。故本研究经过进一步尝试,在天灸2 h时加药1次,保证了持续性的药物刺激,最终获得了稳定的发泡。本研究还发现,在首次贴药刺激2 h后只用加斑蝥酊1次即可稳定发泡,不需要加药多次。多次加药对大鼠皮肤有直接的损伤,会造成大鼠皮肤发红、溃烂,同时大鼠会出现明显的狂躁多动等不良情况。详见表4。

表3 天灸不同时间大鼠发泡及泡体大小比较

表4 不同给药次数大鼠发泡率比较 (只)

2.5 不同部位发泡的差异性

通过前期预实验,笔者发现大鼠背部可以实现发泡,而腹部不发泡。本研究在前期预实验的基础上又发现大鼠背部尤其以项部两耳后脊柱两旁区域发泡多见(相当于大椎穴处附近),而背部其他区域很少发泡或不发泡。突出表现在大椎穴处发泡情况良好,发泡率≥80.0%;背部中线最高点发泡数量较少,发泡率为40.0%;背部中线最高点两侧0.5cm(相当于膀胱经处)只有一处发泡,发泡率为20.0%。这考虑和大椎穴处附近区域皮肤薄嫩,表皮层疏松、局部皮肤不易被大鼠抓挠以及不易随着大鼠的活动而受到压迫和牵拉有关。故本研究认为大椎穴处附近为适合大鼠发泡的部位。这3处部位也模拟了临床中大椎穴天灸、督灸以及膀胱经穴位天灸,具有一定的临床依据。详见表5。

表5 不同部位、相同斑蝥酊剂量大鼠发泡率比较 (只)

2.6 不同室温大鼠天灸发泡的差异性

表6 不同室温大鼠发泡率比较 (只)

通过对3组不同温度下天灸发泡情况的观察统计,笔者发现温度对发泡没有直接的影响。较低温度(16℃)的发泡率较其他两组稍低,但各组比较差异无统计学意义(＞0.05)。详见表6。

3 讨论

目前,国内外天灸的动物实验研究主要以研究天灸血清为主[6],但是并不发泡[7],这与动物和人类皮肤的差异性、发泡方法、发泡药物和发泡材料的选择等诸多因素有关,也在一定程度上限制了天灸的动物实验研究。笔者发现,天灸发泡的影响因素包括人为因素和非人为因素。其中,人为因素主要包括药物浓度、发泡部位、温度、贴药时间以及是否多次加药;非人为因素主要包括大鼠周龄、大鼠性别等。通过对以上因素进行对比研究,笔者认为人为因素在大鼠斑蝥酊天灸发泡中占主导,尤其以药物浓度、剂量和重复加药为主。5% 200mL的斑蝥酊贴敷于大鼠项部两耳后脊柱两旁区域,并在2 h后重复给药200mL 1次,4 h后可以实现稳定天灸发泡,这是关键环节。在此基础上,笔者也对室温、大鼠周龄和大鼠品系等因素进行了对比,发现均无明显差异性,对大鼠天灸发泡也均无直接影响。另据文献报道,性别差异可加速炎症反应的消退[8],故本研究统一采用雄性SD大鼠发泡,这是为了防止雌激素对发泡的影响。

本实验中涉及的人为因素相对较多,由于大鼠斑蝥酊天灸发泡不是单一因素所主导,而是由药物浓度、剂量和重复加药这3个关键因素共同作用的结果。只控制其中1个因素,均无法实现天灸发泡。故笔者在实验方案的设计方面,以其中1个因素进行对比,其他因素保持同时存在并且条件相同。逐一对这3个因素进 行全面对比后,综合得出了最终的关键因素。其他次要因素,包括发泡部位和室温等,都是在这3个关键因素完全确立的基础上进行的对比。

同时,笔者另一项实验观察了不同时间点发泡区域皮肤组织病理学和泡液改变,发现发泡伴随着棘层的肥厚和松解,而且基底层细胞也有缺失,这与相关文献报道相吻合[9-10]。故笔者认为天灸发泡可能通过影响局部皮肤树突状细胞来发挥作用。在天灸发泡液的研究方面,笔者结合相关文献[11],认为泡液中树突状细胞同样发挥着重要作用。树突状细胞在皮肤和泡液中都有分布,笔者认为它可能作为天灸后皮肤和泡液免疫炎症反应研究新的结合点,有待于进一步试验验证。

此外,在斑蝥酊的有效药理成分方面,笔者通过前期预实验,用斑蝥素代替斑蝥酊,在大鼠皮肤却没有出现发泡的效果,这可能与人类和大鼠皮肤的差异性有关。故笔者认为很可能是以斑蝥素为主的成分刺激了皮肤而起到发泡的效果,但并不单纯是斑蝥素这单一成分。斑蝥素确有肝肾毒性,经查阅相关文献可知,斑蝥酊天灸发泡是一种以斑蝥素为主要成分的发泡刺激,它可以对大鼠肝肾造成一定的损伤,可考虑是造模本身对动物的不良反应[12-15]。但对比上述文献记载,笔者认为无论是参考小鼠或大鼠斑蝥的用量情况,本实验中所选择5%的斑蝥酊浓度是在安全剂量以内,且5%的斑蝥酊不会造成大鼠死亡,一般情况均良好。本实验选择斑蝥作为发泡刺激源,主要是结合了临床上斑蝥的发泡是在皮肤上形成类似烫伤后透亮的水泡,而白芥子的发泡是贴敷部位皮肤出现红肿,高出周围皮肤,却无类似烫伤后透亮的水泡。这种现象的产生可能与斑蝥素、白芥子甙生成的硫代异氰酸对羟苄酯对皮肤刺激作用的层次不同有关[16-18]。笔者相信,大鼠天灸后稳定发泡的出现,会对天灸泡液成分的研究及其与体液的相关性研究提供一定的基础,也会在一定程度上推动天灸的动物实验研究进程。

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Study of the Influencing Factors in the Formation of Blisters in Cantharides Tincture Vesiculation Moxibustion in Rats

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,310053,

To study the influencing factors in the formation of blisters in cantharides tincture vesiculation moxibustion in rats.The skin of rats was stimulated by cantharides tincture. The differences in cantharides tincture concentrations, doses, treatment duration, with or without compression after the application, whether or not a repetitive application, blister area and room temperature were observed and counted.With application of 5% cantharides tincture 200mL to the Sprague-Dawley (SD) rats in the bilateral areas near by the spine and behind the ears, and a repeated application 2 h later at the same dose, stable formation of blisters could be achieved 4 h later.For vesculation moxibustion in rats, human factors are the main factors that influence the stable formation of blisters, including medicine concentrations, blister area, application duration of cantharides tincture, whether or not a repetitive application and room temperature. Good control of human factors can enhance the success rate and the stability of SD rat model of vesiculation moxibustion.

Blistering therapy; Moxibustion; Cantharides tincture; Rats

1005-0957(2018)11-1310-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2018.11.1310

2018-06-03

“十三五”浙江省中医药(中西医结合)重点学科建设计划(2017-XK-A18)

肖双凯(1989—),男,2015级硕士生,Email:379691025@qq.com

林咸明(1966—),男,教授,Email:linxianming66@126.com