改进的CTAB法提取32种中药破壁饮片DNA及物种鉴定

王 艳 成金乐

（1 广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心、岭南中药资源教育部重点实验室（广州中医药大学）、国家中成药工程技术研究中心南药研发实验室，广东 广州 510006；2 国家中医药管理局中药破壁饮片技术与应用重点研究室，中山市中智药业集团有限公司，广东 中山 528437）

中药破壁饮片[1]是中山市中智药业集团有限公司研发的一种创新型中药饮片，系指将符合法定标准要求并具有细胞结构的植物类中药饮片，经现代粉碎技术加工至D90＜45 μm（300目以上） 的粉体，不添加成型剂制成30～100目的具有原饮片全成分的均匀干燥颗粒状饮片。中药破壁饮片在保证物质基础没有改变的前提下，将物质成分利用率提高至90%以上，是传统饮片煎煮提取的3倍以上，从而大幅度减少使用剂量。这对于资源紧缺的中药，尤其是贵重药材的可持续利用具有重大的意义。为了保证临床及日常使用的安全有效，中药破壁饮片的真伪鉴别及其重要前提。然而破壁饮片经过破壁粉碎处理后，其粉体粒度非常小，失去了传统中药饮片应有的性状特征和绝大部分的显微特征。利用传统饮片法定标准中的性状鉴别和粉末鉴别法来鉴定中药破壁饮片真实性的可行性比较低。因此，建立一种行之有效、可信可靠的方法来鉴定中药破壁饮片的真实性是非常有必要的。

DNA条形码是近年来发展迅速的可用于动植物物种快速鉴定的技术[2]，是利用基因组中一段公认标准的、相对较短的DNA片段来进行物种鉴定的分子诊断技术，是近年来生物分类和鉴定的研究热点。DNA条形码直接利用物种的遗传信息在分子水平上进行鉴别，为物种鉴定提供了最本质的依据。DNA条形码作为新的分子鉴定技术，在物种鉴定方面有着其他技术无法比拟的优点：①技术指标相对统一：只需选用一个或少数几个合适的基因片段即可对整个属、科甚至几十个科的绝大部分物种进行准确的鉴定；②快速高效；③重复性和稳定性好；④试验过程标准化、简单化；⑤鉴定信息的可管理性：试验所得的物种序列信息可通过互联网和信息平台等在全球范围内实现统一管理和资源共享，有利于构建系统、完整的DNA条形码数据库。

与传统鉴定方法相比，DNA条形码技术可快速有效地达到物种鉴定的目的，并且不受个体形态、大小、发育生长阶段和完整性的影响。DNA条形码是近年来发展迅速的可用于动植物物种快速鉴定的技术，因此也被广泛用于药用植物的物种鉴定工作中。陈士林等[2]应用ITS2、psbA-trnH和COI序列完成了《中华人民共和国药典》2010版208味中药材原动植物及1000余种混淆品种的DNA条形码鉴定。同时该课题组对6000余份药用植物样本进行DNA条形码序列筛选，提出以ITS2（Internal Transcribed Spacer 2）作为药用植物标准DNA条形码[3]，以psbA-trnH作为辅助的药用植物鉴定技术的思路[4]。马新业等[5]研究发现psbA-trnH在药用蕨类中具有较高的PCR扩增率和物种鉴定率，并建议psbA-trnH作为蕨类中药的DNA条形码序列。朱英杰等[6]对重楼属11个物种17份样品的psbA-trnH、rpoB、rpoC1、rbcL、matK和核ITS2序列进行分析，发现ITS2序列在重楼属中的鉴定成功率达到100%。

中药破壁饮片是一类创新型中药饮片，经过破壁处理后已完全失去外观形状，无法进行传统的性状鉴别。同时，由于破壁粉末粒径极小，显微特征也大多缺失。因此，传统鉴定方法已不能适用于破壁饮片的鉴别，而DNA条形码正好提供了一个强大的鉴别手段。《中华人民共和国药典》 （2010年版第三增补版）收录了DNA条形码技术，作为中药材质量控制的新方法[7]。近几年来，相关课题组成员已针对中药破壁饮片的DNA条形码鉴别展开了一系列的科研实验，并且已经利用psbA-trnH片段鉴定罗汉果和山药破壁草本[8]。向丽等[9]选用ITS2序列作为DNA条形码对全草类、根及根茎类、叶类、花类、果实类和种子类的31种代表性中药（28个物种）的原药材、超微饮片及破壁饮片共93份样品进行研究，验证DNA条形码技术对中药超微饮片和中药破壁饮片基原物种追溯的可靠性。DNA条形码技术近年来在中药的鉴定应用方面的推广，为破壁饮片等粉末或颗粒状中药制品的物种鉴定提供了很好的技术参考。DNA条形码在破壁饮片的物种鉴定的成功应用，也对后者的质量控制发挥了重要的作用。而对于DNA提取的方法，通过实验研究也有很多种，如氯化铯法、SDS法和一管法等[10]，并把它运用在动、植物和微生物的DNA研究中。由于这些DNA提取方法有的成本高和使用会造成环境污染，且提取效果不够理想。随着这一技术逐步改进，如Saghai-Maroof等[11]研发出十六烷基三甲基溴化铵 （CTAB）法用于提取植物DNA等，使得DNA的提取相对较为快捷，提取的DNA质量较高。本实验应用改良的CTAB法提取32个中药破壁饮片品种的DNA，以ITS2为鉴定序列，其方法简单可行，能高效达到提取样品中的DNA并测序成功及物种鉴定。

1 基本原理

利用CTAB在高离子强度的缓冲溶液中与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，但不沉淀核酸的特性，用离心获得含DNA的上清液；用氯仿和异戊醇混合液使蛋白质变性、分层，同时除去脂类的方法，从而达到提取和纯化DNA的目的。

2 材料及仪器

2.1 实验材料 白芍（批号：20141205）、大枣（批号：20141208）、槐花（批号：20140722）、荷叶（批号：20140901）、鸡骨草（批号：20141216）、木棉花（批号：20141231）、人参 （批号：20141221）、熟三七（批号：20141202）、山银花（批号：20141214）、太子参（批号：20141207）、盐补骨脂（批号：20141203）、薏苡仁（批号：20140729）、枳实（批号：20140326）、木瓜（批号：20141205）、百合（批号：20140805）、葛花（批号：20140715）、莲子、（批号：20140729）、白术（批号：201709P001）、白芷（批号：20170502）、川芎（批号：20171201）、桔梗（批号：20170701）、女贞子 （批号：20170602）、肉苁蓉 （批号：20170801）、玄参（批号：20170701）、白茅根（批号：170801）、炒麦芽（批号）、佛手（批号：170901）、柯子（批号：C-170157）、南沙参（批号：B705101-01）、桑葚（批号：171001）、冬凌草（批号：A170601）、五指毛桃（批号：170102）

2.2 试剂 主要有NaCl、EDTA、Tris、HCl、CTAB、β-巯基乙醇、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇、PVP-40等。

2.3 实验仪器 生物样品均质仪（爱施德，Bioprep-24）、低 温冰 箱 （Eppendorf，5430R）； 多 功能PCR仪（Biometra，Flex Cycler 2）；水平电泳仪 （Bio-Rad）；凝胶成像仪（Biometra，BDA digital）。

3 实验方法

3.1 CTAB溶液的配制 CTAB缓冲液配制如表1。

表1 3%CTAB（1000 mL）缓冲液配制成分表

3.2 DNA提取 取已研磨好的样品50 mg，向各样品管中加入800 μL核分离液 （100 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L EDTA，0.7 mol/L NaCl，20 g PVP-40，2 mLβ-巯基乙醇）剧烈振荡，旋转混匀5 min，12000 r/min离心3 min，弃去上清液，重复上述步骤1～2次；向各样品管中加入800 μL 3%CTAB缓冲液，充分振荡混匀，65℃金属浴中孵育3 h，期间每隔10 min左右颠倒混匀数下。加入600 μL氯仿-异戊醇 （24∶1，V∶V），充分振荡混匀，12000 r/min离心10 min，小心吸取上清于新的1.5 mL离心管中。加入等体积-20℃预冷的异丙醇，分次转移至吸附柱中12 000 r/min离心1 min，弃去下液。加入700 μL-4℃预冷的75%乙醇，12000 r/min离心1 min，弃尽下液，继续加入500 μL-4℃预冷的75%乙醇，上下颠倒混匀数次，12000 r/min离心1 min，弃尽下液，将空管离心1 min，取出加入50 μL 65℃预热的dd H2O，12000 r/min离心1 min，置于-20℃保存，备用。

表2 ITS2比对结果

3.3 PCR扩增及测序 PCR反应体系：2×Power Taq PCR Master Mix（百泰克，PR1701）12.5 μL，正反向引物：ITS2-2F，ATGCGATACTTGGTGTGAAT；ITS2-3R，GACGCTTCTCCAGACTACAAT各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O补足体积至25.0 μL；阴性对照 （Negative control，NC） 采用ddH2O作为模板。温度程序（ITS2）：94℃，4 min；94℃，30 s；52℃，30 s；72℃，45 s，35个循环；72℃，5 min。反应完成后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测各PCR产物，在目的区域出现清晰条带的样品则送检做Sanger测序[12]。

3.4 数据处理 将测序所得的原始峰图导入Codon-CodeAligner（Version 5.1.5.0） 进行序列处理，去除5.8SrRNA和28SrRNA区以获得ITS2序列。将各样品的ITS2序列作为Quary分别在NCBI、中药材DNA条形码鉴定系统（http://www.tcmbarcode.cn/china/index.php?optionid=174）上做比对，取同源性最高的比对结果。

4 实验结果

利用ITS2片段可以成功鉴定出本研究中的32个中药破壁饮片品种，各样品的ITS2序列比对结果与公共数据库中已有序列的同源性达到95%以上。结果见表2。

5 讨论

中药破壁饮片通过气流破壁技术导致其形态及外观特征发生改变，难以对物种进行准确的鉴定。本文运用DNA条形码技术对32个中药破壁饮片品种进行物种鉴定。实验结果表明改良的CTAB法对于一些炮制过的样品也能成功地提取出DNA，同时也说明破壁技术未对药材的遗传物质产生破坏。在实验研究初期，也尝试使用试剂盒法提取DNA，结果都不理想，而采用改良的CTAB法能达到提取及鉴定的效果。用3%CTAB进行提取，比常规的CTAB法提取出来的DNA更纯，由于植物组织，如叶片中含有较高的多酚、蛋白质、脂类、多酯的角质等不利于DNA提取过程中干扰物质的去除，利用常规的CTAB方法等难以获得高质量DNA。主要原因是提取所得的DNA样品中含有较高含量的蛋白质，甚至具有多酚氧化的褐色物等，从而影响利用DNA进行进一步的特性分析（如酶切，PCR反应等）。运用DNA条形码技术对中药破壁饮片进行鉴定可以不受药材外部形态不完整或已被加工成粉末、饮片的影响，能直接在分子水平上对中药材进行快速准确鉴定，为中药破壁饮片的真伪鉴别提供有效手段。