基于正交试验的溞-藻组合净化富营养化水体研究

曾 琪，聂呈荣 ，肖 燕，邓冬梅，管依依，黄 钰，邓日烈，温玉辉，董 珊

（佛山科学技术学院园艺系，广东佛山528231）

微藻可高效利用水体中的氮、磷等物质进行光合作用，具有吸收水体中有毒物质或降解有机污染物的能力[1-2]，迄今已筛选出了许多可高效净化水质的藻种[3-6]，以绿藻居多。Singh等比较了多种藻类，认为小球藻是去除污水中氮、磷等物质效率最高的藻类之一。小球藻（Chlorella）为绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，生态分布广泛，环境适应能力强。小球藻作为水体中的初级生产者，营养价值较高,可作为鱼类等水生动物的饵料，在污染物沿食物链传递的过程中起着重要作用。如吕福荣等[7]对小球藻净化污水中氮、磷能力进行了研究，证明了小球藻有较好的净化能力。

但藻类的过量生长会引起藻类密度过大而影响生态系统中其他生物的生长，从而破坏生态系统的稳定性。国内外研究中，对于藻类控制的最有效且最生态的方法就是利用生物操纵原理来控制藻类生长，即主要通过去除摄食浮游生物或者降低浮游生物食性鱼的数量，增加浮游动物的生物量，促进滤食效率高的植食性大型浮游动物的生长，从而提高浮游动物对浮游植物的摄食效率，最终降低浮游植物的生物量[8]。大型溞作为湖泊、水库常见的一种大型浮游动物，生长、繁殖速度快,优势种时间长，具有较强的摄食潜力，可望按照生物操纵原理，达到控制富营养化水体浮游植物过量增长的目的。目前在国内外研究中利用枝角类浮游动物控制藻类净化富营养化水已有许多成功案例，张喜勤[9]等人曾研究过水溞对富营养化水体的净化作用，试验表明水溞能够有效净化富营养化水体，使其氮、磷浓度有效降低，提高水体透明度。

但是关于水溞与藻类联合修复富营养化水体的研究并不多，本实验为室内试验，采用四要素三水平正交试验方法，探究在相同环境条件下小球藻量、水溞数量、富营养化水体及净化时间这4个因素对富营养化水体净化效果的影响，通过极差分析和实验组之间的差异性分析，探寻净化富营养化水体最优方案，期望为富营养化水体的治理提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料来源

（1）小球藻。小球藻藻种由华南农业大学生态研究所提供，实验室培养采用BG11培养液培养[10]。

（2）大型溞。大型溞取自广东省佛山市狮山镇兴贤村，试验水溞属于同一母体的纯种体系，于恒温培养箱培养。

（3）富营养化水体的配制。为了避免由人工配制的富营养化水体中缺乏自然水体中所含的天然成分从而对小球藻和水溞生长造成影响，本试验在采用经含氮磷过量的污泥浸泡过的水体经稀释后，配置成总氮浓度为11.2 mg/L、总磷浓度为1.3 mg/L的富营养化水体。

1.2 实验方法

1.2.1 试验设计

本实验采用L9（34）正交试验方法，以水溞量A、小球藻量B、试验富营养化净化水体体积C以及净化时间D为探究因素，每个因素取3个水平，采用L9（34）正交表，共9个处理组，如表1所示。于实验第1、3、5、7、9 天测定每个处理组的总氮（Total Nitrogen，TN）、总磷（Total Phosphorus，TP）、化学需氧量（Chemicl Oxygen Demand，COD）、生化需氧量（Biochemical Oxygen Demand，BOD）、浊度、溶解氧（DO）以及pH值这7个水体理化指标。探究在相同环境条件下小球藻量、水溞数量、富营养化水体及净化时间这4个因素对富营养化水体净化效果的影响，通过极差分析和实验组之间的差异性分析，并探寻净化富营养化水体最优方案。

表1 L9（34）因素水平

1.2.2 实验材料的培养

（1）藻的培养。将小球藻藻种分别接种在10个250 mL装有150 mL的BG11培养液无菌锥形瓶中（BG11培养液经过高温灭菌处理），放置于恒温25℃、光强2 500 lx的培养箱中进行通气培养，光暗时间比为16 h∶8 h。每天摇晃5次培养瓶1 min，防止藻体沉降。当藻液浓度达到对数生长期即1×106个/mL时用BG11培养液扩繁代用（5 d达到对数生长期，接种10 d后扩繁）。

（2）大型溞的培养。用无菌吸管分别吸取出6个带卵的母体溞于6个装有经过无菌培养的150 mL藻液的250 mL锥形瓶中，以获得同一母体的纯种体系。并将其放置于恒温25℃、光强为1 200 lx的培养箱中进行培养，光暗时间比为14 h∶10 h。实验前15 d，选取获得纯种体系大型溞最多的烧杯中的成年溞和幼体溞分离培养于3个装有150 mL藻液的250 mL无菌锥形瓶中，每天早晨8：00喂食蛋白核小球藻藻液，48 h更换藻液一次，保证食物充足。实验时，从3个预培养体系中用橡皮吸管吸取大小一致的水溞作为试验水溞（放入水溞前在蒸馏水中空腹24 h）。

1.3 数据统计与分析

1.3.1 藻细胞密度

小球藻密度用分光光度法测得。取一定量的藻种在显微镜下计数，并按一定的稀释倍数逐级进行稀释，得到相应的藻细胞密度，再将所得到的系列藻液用分光光度计在680 nm波长下测定吸光度，得到吸光度-密度标准曲线。将每天测定藻液的吸光度代入标准曲线即可得出藻细胞密度[11]。

1.3.2 各理化指标的测定

（1）TN的测定。TN采用过硫酸钾氧化紫外分光光度法（GB11894—89）测定。

（2）TP的测定。TP采用过硫酸钾氧化钼锑抗分光光度法（GB11893—89）测定。

（3）BOD的测定。BOD采用标准稀释法测定。

（4）COD的测定。COD采用重铬酸钾法测定[12]。

（5）pH值和DO的测定。pH值和DO分别用便携式pH计和便携式溶氧仪测定。

水体中的TN、TP、COD以及BOD以其去除率来表示其净化效果，其计算公式分别为

将所得数据应用Excel统计软件进行直观分析和SPSS软件进行多重比较分析，并用LSD多重比较方法检验实验各处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 各处理组对富营养化水体的净化效果

各组处理对TN、TP、COD、BOD以及浊度的去除率、DO和pH值的变化量，结果如表2所示。

表2 各处理组对富营养化水体的净化效果

（1）这9个处理组对水体中的TN、TP、COD、BOD及浊度均达到了不同程度的去除效果，对TP和浊度的去除效果尤为显著，最高可达84.58%和503.88%。第6组处理对TN、TP、COD的去除率最高，分析其原因可能是该组合中小球藻数量最大，而水溞数量适中，使小球藻数量没有达到该环境中的最大容纳量并使其能够快速生长，从而使水中的TN、TP能够达到快速去除。

逆模型补偿器需要建立补偿对象的逆模型，逆模型的建立一般采用软件实现，常用的方法有查表法、多项式逼近法和神经网络人工智能建模等方法。因为径向基函数神经网络具有能以任意精度逼近任意连续函数的特性，而在各种系统建模中得到广泛应用。标准RBF神经网络的基本结构如图4所示，RBF神经网络一般由输入层节点、隐含层神经元、输出层神经元及输出权值矩阵组成[7]。

（2）9个处理组对TN的去除效果都没有达到显著水平。说明水溞量、小球藻数量、富营养化水体积及处理时间的水平设置不够合理，应进一步进行单因素重复试验进行探究这4因素对TN的去除效果。第3组处理对水体中溶解氧含量增加最大且与其他组处理差异显著（p＜0.05）。第8组处理对浊度的净化效果最佳且与其他组处理组间差异显著（p＜0.05）。第9组处理对BOD、pH值的净化效果最佳且与其他处理组处理间存在差异显著（p＜0.05）。同一处理组对水体中不同指标的净化效果不一样，这可能是各测量指标的主要影响因素不同所致。

2.1.1 各试验因素对水体中TN去除效果的影响

各试验因素对水体中TN去除效果的影响如表3所示。

由表3可以看出，1）实验设计的水溞数量水平对TN的去除效果有一定的峰值，水溞数量在30个时最佳。2）小球藻对TN的净化效果不成规律变化，说明实验设置的水平不佳，需进一步探究实验。3）被净化的富营养化水体积越小，净化效果越明显。4）随着净化时间的延长，TN去除率在前3 d随着时间的增加而增加，但是3 d后TN去除率下降。

表3 各试验因素对TN去除效果的极差分析表

通过极差分析可知，影响TN去除率因素的主次顺序依次为D、C、B及A，这4因素中对TN去除率最高的水平分别是A2、B3、C1、D2。因此，这4因素对TN去除效果最佳的最优组合为A2B3C1D2。

2.1.2 各试验因素对水体中TP去除效果的影响

各试验因素对水体中TP去除效果的影响如表4所示。

表4 各试验因素对TP去除效果的极差分析

通过极差分析可知，影响TP去除效果因素的主次顺序依次为D、B、C、A，这4因素中对TP去除率最高的水平分别是A2、B3、C1、D2。因此，这4个因素对TP去除效果最佳最优组合为A2B3C1D2。

2.1.3 各试验因素对水体中COD去除效果的影响

各试验因素对水体中COD去除效果的影响如表5所示。

表5 各试验因素对COD去除效果的极差分析

由表5可知，1）水溞数量、小球藻数量对水体中COD的去除效果呈正相关，其数量越大，去除效果越明显。2）富营养化水体积的越小，COD的去除率越高。3）净化时间在前3 d随着时间的延长，去除效果明显，3 d后去除效果有所降低。

通过极差分析可知，影响COD去除效果因素的主次顺序依次为D、B、A、C，这4个因素中对COD去除率最高的水平分别是A3、B3、C1、D2。因此，这4个因素对COD去除效果最佳的最优组合为。

2.1.4 各试验因素对水体中BOD去除效果的影响

各试验因素对水体中BOD去除效果的影响如表6所示。

表6 各试验因素对BOD去除效果的极差分析

由表6可知，1）水溞数量越大对BOD的的去除效果越大。2）小球藻数量、净化时间对BOD的去除效果呈负相关，小球藻数量越大，净化时间越长，去除效果越低。

通过极差分析可知，影响BOD去除效果因素的主次顺序依次为A、D、C、B。这4个因素对BOD去除率最高的水平分别是A3、B1、C2、D1。因此，这4个因素对BOD去除效果最佳的最优组合为A3B1C2D1。

2.1.5 各试验因素对水体中浊度的净化效果影响

各试验因素对水体中浊度的净化效果影响如表7所示。

表7 各试验因素对浊度去除效果的极差分析

由表7可知，1）水溞量、小球藻量及净化时间这3因素对水体中浊度的净化效果呈正相关，其数量越多，净化时间越长，净化效果越明显。2）富营养化水体积对浊度的净化效果在100～200 mL时，随着体积的增大，净化效果降低；在200～300 mL时，随着体积的增大，净化效果增大。

通过极差分析可知，影响浊度去除效果因素的主次顺序依次是D、C、A、B，这4个因素中对浊度去除率最高的水平分别是A3、B2、C1、D3。因此，这4个因素对浊度去除效果最佳的最优组合为A3B3C1D3。

2.1.6 各试验因素对水体中DO含量变化的影响

各试验因素对水体中DO含量变化的影响如表8所示。

表8 各试验因素对DO含量变化影响的极差分析

由表8可以看出，1）水溞数量越多，DO降低的幅度越大。2）净化时间越长，DO增加的幅度越大。3）当小球藻数量小于6×109时，DO含量随着其数量增加而增加，但当小球藻数量大于6×109，又随着其含量的增加而降低。4）富营养化水体积在第3水平时达到最佳。

通过极差分析可知，这4个因素对水体中DO含量变化影响的主次顺序依次为D、A、C、B，4个因素中对DO含量增加最高的水平分别是A1、B2、C3、D3。因此，这4个因素对水体中DO去除效果最佳的最优组合为A1B2C3D3。

2.1.7 各试验因素对水体pH值变化量的影响

各试验因素对水体pH值变化量的影响如表9所示。

表9 各试验因素对pH值变化量影响的极差分析

由表9可知，1）水溞数量越大，pH值变化越小，小球藻数量越大，pH值变化越大。2）富营养氧化水体积对pH值变化影响差异不大。3）净化时间在1～3 d时，pH值变化量随着时间的延长而增大；在3～5 d时，pH值随着时间的延长而变小。

通过极差分析可知，影响水体中pH值变化量的主次因素依次为D、A、B、C。4因素中对pH值影响最低的水平分别是A1、B1、C2、D1。因此，这4因素对pH值净化效果最佳的最优水平为A1B1C2D1。

2.2 各试验因素水平对水体净化效果的最优组合

综合以上的水平选优分析4个因素对水体中重要指标的影响因素的主次顺序进行筛选，选出4个因素对水体的净化效果最佳的最优组合。根据造成水体富营养化的原因分析，可判断影响水体富营养化程度的水体指标主次顺序依次为TN、TP、DO、COD、BOD、浊度及pH值。

于是，4个因素影响富营养化水体净化效果的主次因素汇总如表10所示。

表10 4个因素影响富营养化水体各指标净化效果的主次因素汇总

由表10可知，1）对于净化时间D因素而言，D是影响7个指标中的主要因素，而且TN、TP及COD这3个主要指标的最优水平都是D2，即处理的净化时间为3 d。因此，该实验的最佳净化时间为3 d。2）对于水溞A因素而言，A1、A2均出现了两次，A3出现了3次，但是A2出现在主要指标上，故选择A2水平为最优水平。3）对于C因素而言，TN、TP、COD、BOD及浊度这5个指标的最优水平都是C1，故C1为最优水平。4）对于B因素而言，B3出现的次数最多且在主要指标上出现，故B3为最优水平。

由以上结论可得出最优水平为A2B3C1D3，即当水溞数量为30个、小球藻数量为10×109个、富营养化水体体积为100 mL以及净化时间为3 d时达到最佳。

3 小结与讨论

3.1 小结

（1）在水溞与小球藻的组合作用下，对富营养化水体中的TN、TP、COD、BOD、浊度、DO及pH值均有不同程度的净化效果，对TP和浊度的净化效果尤为显著，最高去除率可达84.58%和503.88%。

（2）影响TN去除率因素主次顺序依次为D、C、B、A；影响TP去除效果因素的主次顺序依次为D、B、C、A；影响COD去除效果因素的主次顺序依次为D、B、A、C；影响BOD去除效果因素的主次顺序依次为A、D、C、B；影响浊度去除效果因素的主次顺序依次为D、C、A、B；影响水体中DO含量变化的主次顺序依次为D、A、C、B；影响水体中pH变化量的主次因素依次为D、A、B、C。

（3）通过对7个水体理化指标的最优水平分析，可得出净化水体的最优水平为A2B3C1D3，即当水溞数量为30个、小球藻数量为10×109个、富营养化水体体积为100 mL以及净化时间为3 d时，其净化效果达到最佳。

3.2 讨论

（1）张喜勤等人实验表明水溞能通过摄食水中藻类来净化水体[9]，但是没有对两者的数量关系与净化效果进行进一步的探究。本文实验结果表明当水溞数量为30个、小球藻数量为10×109个、富营养化水体体积为100 mL以及净化时间为3 d时对富营养化水体的净化效果最佳，这为以后利用水溞治理富营养化水体中的藻类数量提供了参考。

（2）在本次实验中发现同一处理组对水体中不同指标的净化效果不一样，这可能是各测量指标的主要影响因素不同所致，应进一步探究每个指标的主要影响因素，方便以后针对不同水体设计不同的净化方案。