转多抗基因新疆大叶苜蓿光合生理特征对土壤水分变化的响应

李敏，苏国霞，熊沛枫，康继月，郭尚洙，王智,*，徐炳成,*

(1.西北农林科技大学黄土高原土壤侵蚀与旱地农业国家重点实验室，陕西 杨凌 712100；2.中国科学院水利部水土保持研究所，陕西 杨凌 712100；3.韩国生命工学研究院植物系统工程研究中心，韩国 大田 305-806)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是一种优良的多年生豆科牧草，具有营养价值高、适应能力强、产量高等特点，有“牧草之王”的美称，在全球范围内被广泛种植，也是我国栽种面积最大的牧草种之一[1]。紫花苜蓿生物固氮和较高的生长速率能够显著改善土壤性状和提高地表盖度，是一种优良的水土保持植物[2]。但苜蓿属于高耗水作物，水分是影响其分布和产量的主要因子。在我国北方旱区，降水量少且年季分布不均，培育具有较强抗旱性的苜蓿品种，对解决因水分亏缺造成的苜蓿品质差、产量低问题，以及促进苜蓿产业的持续发展具有重要意义。

在优良苜蓿品种培育过程中，采用杂交、回交、自然选择以及接种真菌等传统方法可以对苜蓿抗旱性进行改良[3]。相比传统育种方法，转基因技术具有周期短、效率高、成本低且可以定向改良遗传性状等特点[4]。自1986年Deak等[5]首次培育出转pGA471基因苜蓿以来，采用转基因技术已培育出了许多抗逆性强的苜蓿品种，如通过对编码渗透调节物质合成基因[6]、功能性蛋白和有机分子合成酶基因[7]、信号分子与转录因子基因[8]、活性氧清除分子基因[9]等的克隆以及在植物体内的表达，均能够提高苜蓿的抗逆性。

胆碱氧化酶基因(codA)的表达产物甜菜碱是一种重要的渗透调节物质，能够有效地稳定生物大分子的结构和功能，维持酶活性以及膜的高度有序性，从而提高植物的耐逆性[10]。NDPK2基因是与核苷二磷酸激酶(NDPKs)合成密切相关的基因之一，该酶可维持细胞二磷酸核苷(NDP)和三磷酸核苷(NTP)的代谢平衡，与细胞的生长和分化、信号转导密切相关，并参与干旱、热胁迫等响应过程[11-12]。ABF3是编码ABF/AREB转录因子的基因，ABF/AREB转录因子参与脱落酸(abscisicacid,ABA)或胁迫诱导的信号传递过程进而提高植物对环境胁迫的耐受性[13]。Orange基因(Or)能够通过诱导无色质体分化为有色体的代谢途径来促进类胡萝卜素积累，类胡萝卜素为一种光合色素和非酶促抗氧化系统的重要组成成分，在植物的抗逆生理中发挥重要作用[14]。

目前，已对上述4种基因的转基因新疆大叶株系在干旱等胁迫下的生理生化特性进行了研究，但有关光合生理的变化特征还未涉及[15-18]。光合作用作为植物生长发育的基础，能直接反映外界环境因子对植物生理过程的影响。植物对外界环境特征的响应可以通过光合生理特征予以展现，并可通过叶绿素荧光参数的变化来反映[19]。因此，本研究通过设置不同水分条件，模拟土壤水分降低过程中干旱加剧，对比研究了4种转多抗基因株系及其母本新疆大叶苜蓿的光合及荧光参数特征的响应过程和差异，以期明确4种多抗基因的表达对苜蓿抗性生理状况的影响，为苜蓿抗旱新品种的培育提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以新疆大叶苜蓿(NT)及其为母本的4种转基因株系[SN：转拟南芥NDPK2基因(AtNDPK2)；SC：转球形节杆菌codA基因(codA)；SOR：转甘薯IbOr基因(IbOr)；SAF：转拟南芥ABF3基因(AtABF3)]为研究材料。转基因植株由韩国生命工学研究院提供。试验土壤为陕北天然草地耕层(0～30 cm)黄绵土，土壤养分含量分别为：全氮0.28 g·kg-1，全磷0.67 g·kg-1，有机质19.90 g·kg-1。土壤pH值8.21，田间最大持水量(field capacity, FC)为20%，萎蔫系数(wilting point)为4%。

1.2 试验处理

采用盆栽控制试验，规格为10 cm×56 cm(内径×高度)底部封堵的PVC管，每桶装4.5 kg干土，装桶时桶底铺碎石子，沿内壁放一根内径为2 cm的PVC管作为灌水管。

2016年3月中旬，将培养于1/2 MS培养基的各转基因苜蓿幼苗转移到基质[有机质含量>20%、N-P2O5-K2O总养分>1.5%(富含多种矿物质成分)、通气孔隙度>20%、pH 8.12]中于培养箱(光照时间6:00～20:00，温度25 ℃)内进行扩繁，待其生长至分枝期(4月末)后剪取长势一致的枝条在1/4 Hoagland(pH 6.5～7.0)溶液中水培生根，温室光照时间14 h(6:00～20:00)，昼温25～28 ℃，夜温18～20 ℃。培育2周后，当枝条新生根达到10 cm左右，挑选地上和地下部分长势一致的枝条移栽于试验桶中在室外防雨棚下进行土培，每桶1株。苗期充分供水(土壤含水量保持80% FC左右)，并在各桶覆盖2 cm珍珠岩，以减少土壤表面水分蒸发。

当植株处于始花期时开始水分处理(8月1日)，土壤含水量由80% FC逐渐降至70% FC后维持3 d，随机选取3株进行指标测定(8月4日)，继续降至60% FC、50% FC、40% FC后分别于各土壤含水量水平下控水3 d后(8月7日、8月10日、8月13日)测定各项指标(图1)，并保留3桶植株至试验结束用于收取生物量。处理总数=5(株系)×18(重复)=90(桶)。土壤含水量采用称重法控制，控水于每日18:00进行。

图1 土壤水分处理示意图Fig.1 Diagram of soil water treatment

1.3 测定项目与方法

1.3.1光合气体交换参数 采用Li-6400便携式光合仪(LI-COR Inc., Lincoln, NE, USA)测定。在测定当日9:00～11:30选取植株第3茎节充分展开叶进行测定，重复3次。测定时光强设定为1200 μmol·m-2·s-1。项目包括：净光合速率(Pn, μmol·m-2·s-1)，蒸腾速率(Tr, mmol·m-2·s-1)，气孔导度(Gs, mmol·m-2·s-1)，叶片瞬时水分利用效率(WUEi, μmol·mmol-1)=Pn/Tr。

1.3.2叶绿素荧光参数 采用Imaging-PAM荧光仪(imaging PAM, WALZ, effeltrich, germany)测定。测定当日清晨，植株经暗适应30 min后，选取植株第3茎节充分展开叶测定，重复3次。项目包括：初始荧光(Fo)、最大光化学效率(Fv/Fm)、实际光化学效率(ΦPSⅡ)、光化学淬灭系数(qP)、非光化学淬灭系数(NPQ)、表观光合量子传递速率(ETR)。

1.3.3生物量 试验结束后，分别收集每桶植株地上和地下生物量。地上生物量在105 ℃杀青15 min，80 ℃烘干至恒重，最后称其干重(g)。植株根系经水冲洗后装入信封袋在80 ℃烘干至恒重称其干重(g)。总生物量(g)=地上生物量+地下生物量。

1.4 数据分析

采用SPSS 21.0软件对试验数据进行统计分析，用平均值和标准误表示测定结果，分别对同一水分条件下不同株系间以及同一株系不同水分处理下进行单因素方差分析，用LSD进行显著性检验(P≤0.05)，采用SigmaPlot 10.0进行绘图。

2 结果与分析

2.1 转多抗基因新疆大叶苜蓿的光合气体交换参数

在80% FC时，SAF和SOR的Pn值显著高于NT、SC和SN(P<0.05)，SN的Pn值显著最低(P<0.05)。当土壤水分降低至70% FC时，各转基因株系的Pn值间无显著差异但均显著大于NT(P<0.05)，在60% FC时，株系间Pn值无显著差异，50% FC时，SC与SOR无显著差异，但均显著大于其他各株系(P<0.05)。当土壤水分为40% FC左右时，SN、SAF和SOR的Pn相对80% FC分别显著下降了61.0%、75.6%和69.4%(P<0.05)，而NT(6.06 μmol·m-2·s-1)降低幅度最大，显著降低了84.3%(P<0.05)。此时SC的Pn值为21.5 μmol·m-2·s-1，显著下降了43.8%(P<0.05)，但仍显著高于其余各株系(P<0.05)(图2A)。

图2 不同土壤含水量条件下各株系净光合速率、蒸腾速率、水分利用效率及气孔导度变化Fig.2 The leaf net photosynthesis rate (Pn), transpiration rate (Tr), water use efficiency (WUEi) and stomatal conductance (Gs) of all alfalfa lines under each soil water content NT：新疆大叶苜蓿Xinjiang Daye alfalfa；SN：转AtNDPK2基因株系Transgenic AtNDPK2 lines；SC：转codA基因株系Transgenic codA lines；SAF：转AtABF3基因株系Transgenic AtABF3 lines；SOR：转IbOr基因株系Transgenic IbOr lines.不同小写字母表示同一水分处理下株系间差异显著(P<0.05)，括号内不同小写字母表示同一株系水分处理间差异显著(P<0.05)，下同。Different small letters above the bars indicate significant differences between alfalfa lines (P<0.05); different small letters in bracket show significant differences among soil water contents for each alfalfa line (P<0.05). The same below.

在80% FC时，NT和SC的Tr值显著高于SN、SAF和SOR(P<0.05)，SN的Tr值显著最低(P<0.05)。随着土壤水分下降，SC和SOR的Tr值逐渐下降，于40% FC时降至最低，分别显著下降64.2%和74.3%(P<0.05)；NT和SAF的Tr值随土壤水分降低呈先下降后上升再下降的趋势，土壤水分降至40% FC时，NT、SN和SAF分别显著下降82.3%、56.4%和82.8%(P<0.05)，此时SC的Tr值最大且显著大于其他株系(P<0.05)，其他株系间差异不显著(图2B)。

在土壤水分下降过程中，各株系的叶片WUEi值总体呈升高趋势。80% FC时，SN的WUEi显著高于其他株系(P<0.05)，SAF与SOR无显著差异，但均显著大于NT和SC。70% FC时，SC和SAF的WUEi显著低于其他株系(P<0.05)。土壤水分由60%降至40% FC过程中，各株系的WUEi无显著差异，在40% FC时以SAF的WUEi最大(图2C)。

在80% FC时，NT和SC的Gs值显著最高，SAF与SOR无显著差异但显著小于SC和NT，以SN显著最低(P<0.05)。在土壤水分下降过程中，SAF的Gs值一直呈降低的趋势，在40% FC时降至最低值，相对80% FC显著下降了89.0%。SN的Gs值呈先上升后下降的趋势，在70% FC时升至最高值后下降，在40% FC时下降至最低，相对80% FC显著下降77.4%(P<0.05)；NT和SC的Gs值呈先下降后上升再下降的趋势，在40% FC时，NT和SC的Gs值分别显著下降了87.5%和74.4%(P<0.05),SC的Gs值显著高于其他株系(P<0.05)，其他株系间无显著差异(图2D)。

2.2 转多抗基因新疆大叶苜蓿的叶绿素荧光参数

2.2.1初始荧光(Fo) 80% FC时，各株系间的Fo值无显著差异。与80% FC相比，在土壤水分降至40% FC时，SN的降幅最大，显著降低了34.3%(P<0.05)，SAF的降幅最小为8.1%。SC的Fo值在80%和70% FC维持较高水平，而后显著下降。在40% FC时，以SAF、SC和SOR的Fo值最大，但相互间无显著差异。在水分降低过程中，NT的Fo值呈先降后升趋势，40% FC时仅比80% FC低0.3%(表1)。

表1 不同土壤含水量条件下各株系苜蓿叶片初始荧光(Fo)值Table 1 Leaf initial fluorescence (Fo) values of all alfalfa lines under each soil water content

注：同一列数字后不同小写字母表示相同水分条件下品系间差异显著(P<0.05)，括号内不同小写字母表示同一株系水分处理间差异显著(P<0.05)，下同。

Note: Values within a column followed by different small letters indicate significant differences between alfalfa lines under same soil water content (P<0.05). Different small letters within a row in bracket show significant differences among soil water contents for each alfalfa line (P<0.05). The same below.

2.2.2最大光化学效率(Fv/Fm) 80% FC时，SAF的Fv/Fm值显著低于NT和SN(P<0.05)，除SAF外其余4株系间无显著差异(P<0.05)。在土壤水分下降至40% FC时，NT和SOR的Fv/Fm值降至最低值，且NT的Fv/Fm值显著低于其他各株系(P<0.05)，各转基因株系中，以SAF最低，显著低于SN和SC(P<0.05)(表2)。

2.2.3实际光化学效率(ΦPSⅡ) 80% FC下，NT的ΦPSⅡ值显著最低(P<0.05)，4种转基因株系的ΦPSⅡ值间差异不显著，以SOR最高。各株系的ΦPSⅡ值在土壤水分为70% FC时达到最高值后开始下降，在40% FC时降至最低值。在土壤水分为40% FC时，与80% FC相比，NT、SN、SC、SAF和SOR分别显著下降85.7%、76.0%、78.8%、68.0%和62.6%(P<0.05)，SOR的ΦPSⅡ值显著高于SC、SN和NT(P<0.05)，SOR和SAF间差异不显著，NT的ΦPSⅡ值最小且显著小于SOR和SAF(表3)。

2.2.4光化学淬灭(qP)和非光化学淬灭(NPQ) 80% FC下，各株系的qP值间无显著差异，以NT最低。各株系qP值在土壤水分为70% FC时上升至最高后开始下降，在40% FC时降到最低，与80% FC相比，NT、SN、SC、SAF和SOR的qP值分别显著下降78.0%、65.9%、69.2%、55.8%和51.1%(P<0.05)，SAF的qP值显著高于SC和NT，与SOR间无显著差异，且SC和NT二者差异不显著，以NT的qP值最低(表4)。

表2 不同土壤含水量条件下各株系苜蓿叶片最大光化学效率(Fv/Fm)值Table 2 Leaf maximum photochemical efficiency values of PSⅡ (Fv/Fm) values of all alfalfa lines under each soil water content

表3 不同土壤含水量条件下各株系苜蓿叶片实际光化学效率(ΦPSⅡ)值Table 3 Leaf active photochemical efficiency values of PSⅡ (ΦPSⅡ) values of all alfalfa lines under each soil water content

表4 不同土壤含水量条件下各株系苜蓿叶片光化学淬灭(qP)值Table 4 Leaf photochemical quenching coefficient of PSⅡ (qP) values of all alfalfa lines under each soil water content

80% FC时，各株系的NPQ值无显著差异。土壤水分下降过程中，SAF和SOR的NPQ值呈逐渐上升趋势，在土壤含水量为40% FC时升至最高值。其他各株系的NPQ值随土壤水分下降总体呈先升后降趋势，NT和SN于50% FC时升至最高值后下降，SC的则为60% FC时升至最高值后下降。40% FC时，NT、SN、SC、SAF和SOR的NPQ值相比80% FC分别显著升高489.4%、606.5%、647.9%、491.8%和307.0%(P<0.05)，SN的NPQ值显著高于NT、SOR和SAF(P<0.05)(表5)。

表5 不同土壤含水量条件下各株系苜蓿叶片非光化学淬灭(NPQ)值Table 5 Leaf non-photochemical quenching coefficient of PSⅡ (NPQ) values of all alfalfa lines under each soil water content

2.2.5各株系表观光合量子传递效率(ETR) 80% FC时，SOR的ETR值显著高于NT(P<0.05)，且4种转基因苜蓿间差异不显著。各株系的ETR值在土壤水分减少时呈先上升后下降趋势。SC和SOR在土壤含水量为50% FC达到最大值，其他株系在60% FC时均升至最大而后下降。在40% FC时，NT的ETR值提高了121.6%，而各转基因株系SN、SC、SAF和SOR的ETR值分别显著升高271.0%、229.0%、395.5%和479.1%(P<0.05)(表6)。

表6 不同土壤含水量条件下各株系苜蓿叶片表观光合量子传递效率(ETR)值Table 6 Apparent electron transport rate values of PSⅡ (ETR) values of all alfalfa lines under each soil water content

2.3 转多抗基因新疆大叶苜蓿的生物量

试验结束时，SN的地上生物量显著大于NT,转基因株系SC和SOR与NT间无显著差异，而SAF则显著小于NT。各株系间地下生物量均无显著差异；总生物量以SN最大，且显著大于NT(P<0.05)，4种转基因苜蓿株系的总生物量无显著差异。SC、SN、SOR和SAF苜蓿的总生物量较NT分别提高了12.3%、36.5%、29.4%和13.8%(图3)。

图3 各株系地上生物量、地下生物量和总生物量Fig.3 The shoot biomass, root biomass and total biomass production of each alfalfa line

3 讨论

水分是影响植物光合生理特性的重要因子[20]。水分胁迫会引起植物气孔关闭，降低叶绿体活性，影响电子传递、光合磷酸化及暗反应等一系列过程，使植物的光合速率降低[21]。光合作用是受水分胁迫影响最为明显的生理过程之一，叶绿素荧光参数更具有反映气体交换“内在性”特点，所以常用于评价环境胁迫对植物叶片光合器官结构与功能的影响[22]。叶绿素荧光参数中的初始荧光(Fo)值是PSⅡ反应中心处于完全开放时的荧光产量，其减小表明天线色素热耗散增加，增大表明PSⅡ反应中心遭受严重损伤，而最大光化学效率(Fv/Fm)的高低与植物光合速率的高低密切相关[23]。本研究中，当土壤水分从80% FC降至70% FC时，非转基因、转AtABF3和转IbOr基因株系的Pn、Gs值显著下降，但三者的Fv/Fm并未发生显著变化，说明此阶段光系统并未受到损伤，且Pn下降可能是由于Gs下降造成胞内CO2供应不足即气孔限制引起的[24]。当土壤水分从60% FC降至40% FC时，各株系的Pn和Gs值均显著下降，但转基因株系的Fv/Fm值均未发生显著变化，仅非转基因株系的Fv/Fm值显著下降，且从50% FC降至40% FC时，其Fo值显著上升，说明此阶段NT的Pn值下降不仅受气孔限制影响，其光系统也受到严重损伤，而各转基因株系Pn值下降的原因仍然是气孔限制[25]。

在土壤水分下降过程中，以转codA基因株系Pn值最高(图2)，尤其是土壤水分为50% FC和40% FC时，除与转IbOr基因株系无差异外，均显著大于其他各株系，这可能与codA基因参与渗透物质甜菜碱的合成而使植株维持较高的渗透压有关。研究表明，转codA基因新疆大叶株系的甜菜碱、脯氨酸和叶片相对含水量在干旱胁迫下均能维持较高水平且显著大于非转基因植株[16]，Sakamoto等[26]对转codA基因水稻(Oryzasativa)的研究指出，叶肉细胞中甜菜碱含量的增加对转基因植株的PSⅡ反应中心可提供更有效的保护。植物PSⅡ反应中心的活性可用表观光合量子传递效率(ETR)来反映，它是表征光合能力大小的有效参数[27]。本研究中转codA基因株系ETR值在50% FC降至40% FC时显著下降，而其他株系的ETR值出现显著下降时的土壤含水量均要高于此(表6)，说明转codA基因株系PSⅡ反应中心活性受损程度较其他株系要小[28]。因此转codA基因株系具有高光合速率的原因可能是codA基因过表达使植物体内甜菜碱含量增多，从而维持细胞在干旱胁迫下的渗透压、提高PSⅡ反应中心抗性，保持其转基因株系在干旱胁迫下的高光合效率。

植物的实际光化学效率(ΦPSⅡ)是评价光合电子传递速率快慢的指标，也可反映植物PSⅡ反应中心活性[29]。本研究中，各株系叶片ΦPSⅡ和ETR值随土壤水分下降均呈先升高后降低的趋势，但二者发生显著降低时所对应的土壤水分存在差异(表3和表6)。ΦPSⅡ值在土壤水分从70% FC降至60% FC各株系均显著下降，而ETR值在60% FC降至50% FC以及50% FC到40% FC才显著下降，说明ETR值变化要滞后于ΦPSⅡ值，这可能是因为植物为了有效适应干旱胁迫，将光反应中心大量电子分配到光化学反应中[30]。当土壤水分为50% FC和40% FC时，转基因株系的ΦPSⅡ和ETR值均显著高于非转基因，说明转基因株系的光系统对干旱胁迫具有更强的耐受性[31]。在各转基因株系中，以转IbOr基因的ΦPSⅡ值和ETR值显著最高，说明转IbOr基因株系能在干旱胁迫下PSⅡ反应中心维持较高的电子传递效率[27]，这是其具有较高Pn值的重要原因，同时转IbOr基因株系的非光化学淬灭系数(NPQ)的变化也可对此做出进一步说明。NPQ是衡量过剩激发能耗散的重要指标，植物可通过增大NPQ将过剩光能耗散以保护光合器官不受损伤来适应外界环境变化。在土壤水分下降过程中，转IbOr基因株系的NPQ值变化幅度最小，且在40% FC时仍能显著上升(表5)，说明其能通过增加热耗散对光系统起到了很好的保护作用[32]，这是其体内类胡萝卜素含量上升所导致的。类胡萝卜素在淬灭过剩光能使光系统在胁迫下免遭严重损伤中起重要作用[33]。IbOr基因能够通过诱导无色质体分化为有色体的代谢途径来促进类胡萝卜素积累[34]，对转IbOr基因新疆大叶株系的研究表明，其总类胡萝卜素及其组分叶黄素、紫黄质的含量较非转基因株系均显著升高，这是转IbOr基因株系具有较高光合速率的物质基础[14]。

在干旱环境下，植物会通过调节碳同化和水分消耗之间的关系来提高叶片水分利用效率(WUEi)[35]，本研究中，各株系Pn下降的同时Tr下降程度更大，说明植株可通过减小蒸腾速率来提高水分利用效率，这是植物的重要抗旱策略之一[36]。在土壤水分为40% FC时，以转AtABF3株系的WUEi最高(图2)，这可能是由于AtABF3基因与脱落酸(ABA)的信号传递过程相关。ABA对气孔开启具有明显的抑制作用，它在植物受到胁迫时可迅速合成并传递至地上部分引起气孔关闭降低蒸腾速率而提高水分利用效率，以更好地应对干旱胁迫[37]。但ABA也可促进子叶脱落、抑制植物细胞生长[38]，转AtABF3基因新疆大叶株系的研究表明，转基因株系的叶面积较非转基因显著减小了30%以上[14]，这是转AtABF3株系的地上生物量显著最低的重要原因之一。地上生物量和总生物量仅有转AtNDPK2株系的显著大于非转基因株系(图3)，这与AtNDPK2基因的功能密不可分。Choi等[39]对拟南芥(Arabidopsisthaliana)ndpk2缺失突变体研究生长发育与NDPK2的关系，发现NDPK2参与生长素相关的子叶发育、生长素极性运输等，以促进植物生长发育；也有研究表明AtNDPK2基因的过表达会促使吲哚乙酸分泌，可促进细胞分裂分化和促使植物生长，这是转AtNDPK2株系地上生物量和总生物量显著大于非转基因的原因之一[40]。

综上所述，在土壤水分下降过程中，转基因株系在光合生理中表现出了优于非转基因的特性，其中转codA基因株系可维持较高的净光合速率，转AtABF3基因株系能够高效利用水分，转IbOr基因株系能够维持较高的光能利用能力，转AtNDPK2基因株系的地上生物量显著提升。本研究主要是在始花期开展的短期初步探索，转基因能否对苜蓿整个生育期的光合及最终产量产生影响，还需进一步就各株系在不同生育期的光合生理及其根冠生长进行更深入系统的研究，为高产优质耐旱苜蓿新品种的培育奠定基础。