硒代蛋氨酸对条纹锯生长性能、组织硒含量、抗氧化能力及血清生化指标的影响
2018-11-16张清雯邵彦翔赵亭亭
张清雯 陈 超 邵彦翔 赵亭亭
(1.中国水产科学研究院黄海水产研究所，农业部海洋渔业可持续发展重点实验室，青岛 266071；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306)
硒(Se)是生物必需的微量矿物元素，是谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和脱碘酶(DIO)的组成成分，硒可以利用还原的谷胱甘肽，将过氧化氢和脂肪酸过氧化氢转化为水和脂肪酸，从而保护细胞膜免受氧化损伤，在水产动物生长性能、抗氧化能力、免疫功能等方面有重要的作用[1-2]。硒代蛋氨酸(Se-Met)是有机硒的一种，是一定条件下由硒元素取代了蛋氨酸中同族的硫元素而合成[3]。与无机硒被动扩散的吸收方式不同，含硒氨基酸、酵母硒等有机硒在小肠通过主动运输的方式被吸收，具有吸收快、利用率高、毒副作用小、环境污染少的特点[4]。有机硒在提高生长速率、抗氧化能力、免疫力等方面的应用广受关注，作为饲料添加剂在畜禽应用十分广泛，但是在水产养殖中少有研究。
1 材料与方法
1.1 试验材料与试剂
试验用硒代蛋氨酸为L-硒代蛋氨酸，购于上海源叶生物科技有限公司，纯度为98%。
GPx、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、溶菌酶(LZM)活性，总抗氧化力(T-AOC)，总蛋白(TP)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)含量检测试剂盒均购于南京建成生物试剂研究所。免疫球蛋白M(IgM)含量酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司。
1.2 试验饲料
基础饲料以酪蛋白和明胶为主要蛋白质源，鱼油和豆油为主要脂肪源，并添加矿物元素和多维配制而成。基础饲料中硒代蛋氨酸的添加水平分别为0(对照组)、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/kg，硒含量实测值分别为0.09(对照组)、0.21、0.44、0.58、0.77、1.05 mg/kg。试验饲料组成及营养水平见表1。所有饲料原料粉粹后过80目筛，采用逐级扩大法混匀，加鱼油和豆油搓匀至无油粒，加适量水搅拌后用挤条机制成直径为3 mm的颗粒饲料，于烘箱内12 h烘干，分组装袋并置于-20 ℃冰箱内备用。
1.3 试验设计和饲养管理
表1 试验饲料组成及营养水平(风干基础)
1)维生素预混料为每千克饲料提供 The vitamin premix provided the following per kg of diets：VB175 mg，VB2200 mg，叶酸 folic acid 20 mg，VB650 mg，烟酸 niacin 500 mg，泛酸钙 calcium pantothenate 300 mg，肌醇 inositol 1 000 mg，生物素 biotin 6 mg，VE 500 mg，VK 60 mg，VB121 mg，维生素A乙酸酯 VA acetate 15 mg，VD 0.05 mg，VC 200 mg。2)矿物质预混料为每千克饲料提供 The mineral premix provided the following per kg of diets：FeSO4·H2O 8 g，CuSO4·5H2O 1 g，MnSO4·H2O 2 g，ZnSO4·7H2O 30 g，MgSO4·7H2O 150 g，CaI20.5 g，CoSO4·7 H2O 0.1 g，KCl 70 g，沸石粉 zeolite powder 738.36 g。
试验用水为山东日照地下海水，pH为6.8～7.3，整个试验期水温在18～24 ℃，海水盐度为22‰～24‰，氨氮浓度小于0.2 mg/L。24 h不间断充气泵增氧，溢流水环境。每2周取海水检测其中硒含量，试验过程中没有检测到硒。
1.4 样品采集
试验结束时，所有鱼饥饿24 h后，用100 mg/L的丁香酚轻微麻醉试验鱼，对每个养殖桶中的鱼计数、称重，计算增重率(WGR)和存活率(SR)。所有鱼测完体重后，每个养殖桶中随机取5尾鱼进行尾静脉取血，装入1.5 mL离心管，然后放置在4 ℃冰箱中过夜，随后3 000 r/min离心15 min，将所得血清分装到1.8 mL冻存管中，暂存液氮罐中速冻，用于测定血清生化指标和抗氧化酶活性。取肾脏、肝脏、肌肉用塑封袋分装，于-20 ℃冰箱中保存，用于测定硒含量。每个养殖桶取5尾鱼，丁香酚轻微麻醉后，取肝脏称重，计算肝体比(HSI)，然后取肌肉，用于测定肌肉基本营养成分(粗蛋白质、粗脂肪、水分、粗灰分含量)。从每个养殖桶中另随机取3尾鱼，麻醉后置于冰盘上，取肝脏并混合放入冷冻管中，迅速放入液氮中，-80 ℃暂存，用于测定肝脏GPx、GR、GST、SOD、CAT活性和T-AOC。
1.5 测定指标及方法
全鱼和饲料中常规营养成分的测定方法采用AOAC法。组织中硒含量采用氢化物原子荧光光谱法测定(GB/T 13883—2008)。肝脏和血清中抗氧化酶活性采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒并使用多功能酶标仪(SpectraMax iD3)测定。血清中LZM活性使用UV-2000型分光光度计测定，TP和IgM含量使用日立7020多功能生化分析仪测定。
生长性能相关计算公式如下：
增重率(%)=[(鱼体末重-鱼体初重)/鱼体初重]×100；存活率(%)=(试验鱼终末尾数/试验鱼初始尾数)×100；饲料系数(FCR)=饲料摄食量/(终末均重-初始均重)；肝体比(%)=(肝脏重量/鱼体重量)×100。
1.6 数据处理
2 结 果
2.1 硒代蛋氨酸对条纹锯生长性能的影响
表2 硒代蛋氨酸对条纹锯生长性能的影响
同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.
图1 饲料硒含量与增重率的二次曲线模型
2.2 硒代蛋氨酸对条纹锯肌肉营养成分的影响
由表3可知，各组之间肌肉水分和粗蛋白质含量没有显著差异(P>0.05)，肌肉水分含量为73.06%～77.32%，粗蛋白质含量为21.53%～22.60%。随着饲料硒含量的增加，肌肉粗脂肪含量呈先降低后升高的趋势，饲料硒含量为0.77 mg/kg组的肌肉粗脂肪含量最高，显著高于除饲料硒含量为0.58 mg/kg组的其他各组(P<0.05)。饲料硒含量为0.44 mg/kg组的肌肉粗灰分含量最高，显著高于其他各组(P<0.05)，其他各组之间无显著差异(P>0.05)。
表3 硒代蛋氨酸对条纹锯肌肉营养成分的影响
2.3 硒代蛋氨酸对条纹锯组织及血清硒含量的影响
由表4可知，各组肌肉和肾脏中硒含量没有显著差异(P<0.05)。肝脏中硒含量随饲料硒含量的增加呈先升高后降低的趋势，饲料硒含量为0.77 mg/kg组的肝脏中硒含量显著高于饲料硒含量为0.09、0.21和0.44 mg/kg组(P<0.05)。血清中硒含量与饲料硒含量的关系与肝脏硒中含量趋势相同，饲料硒含量为0.58 mg/kg组的血清中硒含量最高，显著高于饲料硒含量为0.09、0.21、0.44和1.05 mg/kg组(P<0.05)。对肝脏中硒含量进行二次曲线分析，得出饲料中硒代蛋氨酸的适宜需求量为0.92 mg/kg(图2)。
表4 硒代蛋氨酸对条纹锯组织及血清硒含量的影响
图2 饲料硒含量和肝脏中硒含量的二次曲线模型
2.4 硒代蛋氨酸对条纹锯血清和肝脏中抗氧化酶活性的影响
由表5可知，血清GPx活性随饲料硒含量的升高而升高，饲料硒含量为1.05 mg/kg组的血清GPx活性显著高于其他各组(P<0.05)。血清GR活性随饲料硒含量的升高呈先上升后降低的趋势，饲料硒含量为0.58 mg/kg组的血清GR活性最高，显著高于饲料硒含量为0.77和1.05 mg/kg组。血清CAT活性随饲料硒含量的升高先升后降低，饲料硒含量为0.58 mg/kg组的血清CAT活性最高，显著高于饲料硒含量为0.09、0.21和1.05 mg/kg组(P<0.05)。各组之间血清SOD活性没有显著差异(P>0.05)。血清GST活性随饲料硒含量的升高先降低后升高，饲料硒含量为1.05 mg/kg组的血清GST活性最高，显著高于饲料硒含量为0.09、0.21、0.44和0.58 mg/kg组(P<0.05)。
表5 硒代蛋氨酸对条纹锯血清中抗氧化酶活性的影响
由表6可知，肝脏GPx活性随饲料硒含量的升高呈先上升后降低的趋势，饲料硒含量为0.09 mg/kg组的肝脏GPx活性最低，显著低于饲料硒含量为0.44、0.58和0.77 mg/kg组(P<0.05)。在饲料硒含量为0.09～0.58 mg/kg时，肝脏GR活性随着饲料中硒含量的升高而升高，饲料硒含量为0.09 mg/kg组的肝脏GR活性最低，显著低于饲料硒含量为0.44、0.58和1.05 mg/kg组(P<0.05)。肝脏GST活性随着饲料硒含量的升高呈降低趋势，饲料硒含量为0.09 mg/kg组的肝脏GST活性最高，显著高于饲料硒含量为0.44、0.58、0.77和1.05 mg/kg组(P<0.05)。肝脏SOD活性随着饲料硒含量的升高先升高后降低，饲料硒含量为0.77 mg/kg组的肝脏SOD活性最高，显著高于饲料硒含量为0.09和1.05 mg/kg组(P<0.05)。肝脏CAT活性随着饲料硒含量的升高呈先升高后降低再升高的趋势，饲料硒含量为0.44 mg/kg组的肝脏CAT活性最高，显著高于其他各组(P<0.05)。各组之间的肝脏T-AOC差异不显著(P>0.05)。
表6 硒代蛋氨酸对条纹锯肝脏中抗氧化酶活性的影响
2.5 硒代蛋氨酸对条纹锯血清生化指标的影响
表7 硒代蛋氨酸对条纹锯血清生化指标的影响
图3 饲料硒含量和血清中溶菌酶活性的二次曲线模型
3 讨 论
3.1 硒代蛋氨酸对条纹锯生长性能的影响
3.2 硒代蛋氨酸对条纹锯组织和血清中硒含量的影响
3.3 硒代蛋氨酸对条纹锯血清和肝脏中抗氧化酶活性的影响
硒对生物机体的抗氧化主要是通过GPx等硒蛋白实现的。硒是GPx发挥活性作用必不可少的组分，在其活性中心有4个硒原子结合的硒代半胱氨酸，是氧化还原的中心。GPx是生物机体内重要的抗氧化酶之一，催化还原型谷胱甘肽(GSH)把体内的脂质过氧化物(ROOH)还原为无害的羟基化合物，并分解过氧化氢，从而阻断活性氧自由基(ROS)对机体的进一步损伤[36]。Behne等[37]研究表明，大鼠血浆、肝脏、肾脏和肌肉中GPx活性与硒含量显著相关。GR是一种黄素蛋白氧化还原酶，以还原型辅酶Ⅱ为供氢体，能催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)还原成GSH，对于维持生物体氧自由基的平衡起着重要作用[38]。在本试验中，血清中GPx活性随着饲料中硒含量的增加呈线性升高，肝脏中GPx活性随饲料硒含量升高先升高后降低，且与肝脏中硒含量积累相同，说明组织内高水平的硒可以诱导肝脏中GPx活性，增强机体防御自由基的能力。这与对石斑鱼[30]、军曹鱼[34]的研究结果类似。GST也是生物体内的解毒酶，随着饲料硒含量的升高，其活性降低。
SOD和CAT一起构成机体的抗氧化防御体系，是细胞防御功能的第1道防线。有机硒对于鱼类抗氧化力的影响在石斑鱼[30]、军曹鱼[34]、杂交鳢[39]的试验均有所研究。在正常条件下，超氧阴离子自由基(O2-·)可被SOD催化生成过氧化氢和氧气，再由GPx和CAT分解成水[40]。本试验中，肝脏和血清中SOD活性均随着饲料硒含量升高先升高后降低，与杨原志等[34]试验中硒代蛋氨酸组饲料对于军曹鱼的结果相同，与罗非鱼[25]中血清SOD活性随饲料硒含量先升后降的结果一致。肝脏中CAT活性随饲料硒含量增加呈先升高后降低再升高的趋势，添加硒代蛋氨酸的各组肝脏中CAT活性均高于对照组，与肝脏中SOD活性相同，说明饲料中添加硒代蛋氨酸能够提高机体抗氧化力。
3.4 硒代蛋氨酸对条纹锯血清生化指标的影响
