西藏大麦黄矮病病毒株系鉴定及介体蚜虫传毒能力分析

2018-11-16姚小波王文峰刘何春雷雪萍次仁央拉

西藏农业科技 2018年3期

姚小波，王文峰，李杨，刘何春，雷雪萍，庞博，次仁央拉

(1.西藏自治区农牧科学院农业研究所，西藏拉萨 850032；2.西藏自治区农牧科学院，西藏拉萨 850000)

大麦黄矮病(Barley Yellow Dwarf Virus，简称BYDV)是最重要、分布最广的禾谷类病毒[1]，包括小麦和燕麦等禾谷类作物的主要病害之一。大麦黄矮病病毒由蚜虫以持续性方式传播，病毒在蚜虫体内可存活2～3周，感染植株的韧皮部组织后，细胞大量增殖[2]，引起叶片增厚、发黄。依据蚜虫传播效率与介体专化性，将BYDV划分成PAV、MAV、RMV、SGV、RPV 5个株系，不同株系由不同种类麦蚜传播[3]。每种蚜虫只对其中的1个株系最有效，麦二叉蚜专化性传播SGV分离物，麦长管蚜专化性传播MAV分离物，禾谷缢管蚜专化性传播RPV分离物，禾谷缢管蚜和麦长管蚜两种蚜虫均能有效传播PAV分离物，玉米蚜能有效传播RMV分离物[4]。在我国，Zhou等[5]鉴定出GPV、GAV、PAV和RMV 4种株系。我国大麦黄矮病株系主要有RPV、GAV、PAV 3种，禾谷级管蚜传播的RPV株系；麦二叉蚜、麦长管蚜传播的GAV株系；禾谷缢管蚜和麦长管蚜传播的PAV株系[6]，近几年我国的主流株系为GAV株系。青稞是禾本科大麦属的一种禾谷类作物，内外颖壳分离，籽粒裸露，又称裸大麦，生产上大部分品种对BYDV抗性差，在西藏各冬、春青稞种植区均有不同程度的发生，拉萨、山南尤为严重。黄矮病一般造成青稞减产15 %左右，青稞早期发生黄矮病试验记载平均损失为55 %，甚至可达100 %。

利用系统性杀虫剂控制蚜虫是减轻黄矮病传播流行的重要方法，使用耐病或抗病品种是防治大麦黄矮病最有效的措施，因此明确不同地区大麦黄矮病毒株系，有针对性地培育抗耐病品种是十分必要的。近年来，西藏拉萨、山南麦黄矮病发生日趋严重，而关于该地区大麦黄矮病毒株系类型、介体蚜虫传毒能力尚未见报道。本文对西藏青稞的黄矮病病株进行了血清学鉴定和介体蚜虫传毒能力分析，以期明确该区域的大麦黄矮病毒株系类型和蚜虫传毒能力，为我区青稞抗黄矮病育种工作和田间防控提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 青稞田蚜虫种类调查

从秋季开始至第2年夏结束，从拉萨曲水县、山南桑日县青稞黄矮病发生区定点系统调查。5点取样,不定期从田间采集蚜虫，实验室隔离标记饲养，进行种类鉴定。

1.2 病株采集与保存

2016年5月10～15日，从拉萨、山南不同发病区采集典型新鲜病株，选取山南桑日县冬青稞(冬青18)疑似病株4份，编号sn1、sn2、sn3、sn4；选取拉萨曲水县冬青稞(冬青18)疑似病株6份，编号ls1、ls2、ls3、ls4、ls5、ls6，用于病毒株系鉴定。

1.3 生物学测定

1.3.1 传毒蚜虫及毒源在无毒青稞苗上饲养试验蚜虫，所产若蚜连续多代饲养获得无毒蚜虫，作为实验蚜虫。BYDV-GAV毒源由课题组采集、分离、保存。

1.3.2 饲毒与接种试验盆种植冬青稞冬青18，养虫笼隔离培植无毒苗。用无毒蚜取食感毒青稞，在15 ℃、黑暗条件下，培养2 d获毒，幼苗2叶期接种感毒成蚜虫3头，传毒3 d，喷洒杀虫剂吡虫啉彻底杀死接种麦苗上蚜虫，以不接虫为对照(CK)，充分发病后调查病株率。

1.4 酶联免疫吸附测定

PAV、SGV、RPV、GAV抗血清由中国农业科学院植物保护研究所病毒组提供，饱和硫酸铵法提纯IgG，用碱性磷酸酯酶标记IgG，采用双夹心酶联免疫吸附方法(即DAS-ELISA法)[7]。接种PAV和GAV株系的青稞感病品种“冬青18”为阳性对照，它们的健株为阴性对照。

2 结果与分析

2.1 大麦黄矮病的田间症状及蚜虫种类鉴定

感病植株叶片从叶边缘、叶尖或叶片中间出现不均匀退色斑，褪色区域呈鲜黄色，点片状不均匀褪色是黄矮病最典型特征之一[8]。一般从新叶下1～2片叶开始黄化，自上而下，自叶尖沿叶脉向叶身扩展，逐渐变窄、变厚、质脆，叶背有蜡质光泽。拔节期发病，植株不矮化。孕穗期发病，仅叶发黄，自尖端向下逐渐延伸，根系不健全，主根短，次生根少(图1)。

经拉萨、山南多点、多次田间采样及室内饲养，通过体形、体色、腹管、翅中脉、尾片毛(根)等形态特征鉴别，主要有麦长管蚜[Sitobion avenae(Fabricius)]、禾谷缢管蚜[Rhopalosiphumpadi(Linnaeus)]和麦无网长管蚜[Metopolophiumdirhodum(Walker)]3种(图2)。

2.2 大麦黄矮病病毒株系血清学鉴定

利用BYDV-PAV、GAV、RPV抗血清对待测10份标样株系测定，以毒源GAV、RPV、PAV分离物为阳性对照，健康麦叶作为阴性对照。经鉴定，拉萨曲水6份样本与GAV抗血清有强反应，OD值在0.031～2.331之间，平均为1.102，阴性健株对照值0.027，GAV阳性对照1.034，而与RPV、PAV 2种抗血清无反应，曲水青稞上黄矮病病毒流行株系为GAV。山南桑日县4份标样与毒源GAV、RPV、PAV分离物抗血清无特异反应，标样无我国大麦黄矮病流行株系。

图1 西藏大麦黄矮病的田间症状

图2 西藏常见3种麦蚜

图3 电泳检测结果

2.3 RT-PCR验证

以标样总RNA为模板，阳性对照为阳性质粒，阴性对照为无菌水，设计大麦黄矮病GAV CP基因特异引物，进行RT-PCR扩增，扩增产物琼脂糖凝胶电泳，样品和阳性对照呈现条带，阴性对照无此条带的出现(图3)，BYDV ELISA检测与RT-PCR验证结果相符，GAV株系是拉萨大麦黄矮病主要株系。

2.4 蚜虫传毒能力比较

拉萨、山南3种蚜经纯化后，获得无毒的麦无网长管蚜、麦长管蚜、禾谷缢管蚜，在相同的条件下，饲毒接种，第25天开始发病到第40天病症明显。拉萨、山南两地的麦无网长管蚜、禾谷缢管蚜不传播GAV株系黄矮病病毒。麦长管蚜对黄矮病GAV株系的传毒能力强，拉萨、山南两地麦长管蚜传GAV株系的能力无差异。

3 结论

我们对西藏地区的10份样品经血清学鉴定，拉萨曲水采集6份冬青18样本为黄矮病，经DAS-ELISA法检测，RT-PCR法验证，拉萨曲水青稞黄矮病病毒株系为GAV株系。西藏拉萨、山南麦蚜种群田间调查，该地区蚜虫种群为麦无网长管蚜、麦长管蚜、禾谷缢管蚜。传播的GAV株系的媒介昆虫是麦长管蚜，田间调查发现大量的禾谷缢管蚜、麦无网长管蚜，是大麦黄矮病其它株系媒介昆虫，是否存在其它病毒株系，尚需多点采样进一步分离鉴定。