苏氏接骨胶囊对胫骨干骨折大鼠模型促早期愈合作用及BMP-2表达的影响*

俞 媛 ，杨雅琼 ，冯凯强 ，屈金辉 ，潘雪梅 ，白 雪 ，王 毅

（1．天津市天津医院检验科，天津 300211；2．天津市天津医院药学部，天津 300211）

骨折愈合是一个十分复杂的生物学过程，历经血肿机化期、原始骨痂形成期和骨痂改造塑形期，其修复需要充足的血供和骨折端的稳定固定。如何缩短骨折愈合时间、及早促进骨折愈合、减少并发症的发生，是骨科界亘古不变的关注点。

传统中医药治疗骨折有着悠久的历史，且安全、风险小、疗效确切，体现了中医药治疗骨折的强大优势[1－2]。本研究拟通过建立大鼠胫骨干骨折模型，探索苏氏接骨胶囊（简称Su）对骨折早期愈合的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6周龄雄性SD大鼠36只（SPF级，天津市中西结合骨科研究所动物中心提供），体质量（200±25）g，采用随机数字表法将其分为3组，每组12只，分别为假干预组、Su－140组和Su－280组。标准鼠粮适应性饲养1周，自由饮水，室温（25±2）℃，定期消毒及通风。

1.1.2 药物 Su（天津市天津医院药剂科提供，津药制字 Z20070616，规格为每粒 0．25 g）复方药物，由骨碎补、土鳖虫、续断、煅自然铜、刘寄奴、川芎、当归、三七粉、五加皮、木瓜、熟地黄、补骨脂、无名异、菟丝子、党参、黄芪、煅龙骨、白芍和桂枝19味药物组成。

1.1.3 器材与仪器 一次性无菌注射器（直径为1mm，碧迪医疗器械有限公司提供）；大鼠灌胃器（16码，北京合力科创科技有限公司提供）；金属克氏针（长150 mm，直径1．0 mm，北京蓝港神舟医疗器械有限公司提供）；Micro－CT成像系统（1174V2型，SIEMENS公司，比利时）。

1.2 方法

1.2.1 骨折模型的制备 使用10%的水合氯醛行腹腔麻醉和常规消毒后，无菌条件下于右下肢胫骨内侧缘从粗隆间向下纵行切口，长约2 cm，逐层切开皮肤并剥离部分肌肉组织，利用一根5 mL注射器针头（直径1 mm）于胫骨髌韧带开口，插入已消毒的克氏针并沿髓腔至胫骨粗隆间，然后线锯截断位于胫骨中段前方最高点，致胫骨中段横行骨折。将克氏针继续插入整个胫骨髓腔（穿过已断裂的骨折处），剪断多余的克氏针，远端埋于骨皮质下。碘伏及0．9%氯化钠溶液反复冲洗切口后，使用11号丝线逐层缝合切口。

1.2.2 术后处理 术后立即在麻醉状态下拍摄患肢侧位X线片，观察造模效果。要求骨折类型为胫骨中段横行或短斜形骨折，骨折端内固定理想无明显移位。周期定时添足饲料、更换垫料，饮水不限。1.2.3 给药方法 造模成功后第2天开始通过灌胃方式进行相应的药物治疗。给药剂量经人－大鼠体表面积比值折算成等效剂量[140 mg/（kg·d）]，蒸馏水配制相应浓度的药物混悬液。每只大鼠的给药容积为2 mL，假干预组给予等量的蒸馏水，每日1次至实验取材。

1.3 实验方法和观察指标

1.3.1 标本取材 骨折造模术后第10天，3组大鼠过量麻醉，各组随机抽取6只大鼠行心脏取血备用。所有动物模型处死后，取患侧胫骨全长标本，剔除附着于胫骨干的肌肉，立即行X线检查。随后，各组随机抽取6只进行Micro－CT检查，剩余6只立即投入10%中性福尔马林溶液中固定，待用。

1.3.2 骨痂标本观察 取材后肉眼观察3组大鼠患侧胫骨的骨痂外形，比较3组大鼠骨痂形成的情况以及骨折端的稳定程度。

1.3.3 X线检查 大鼠患侧取材后立即行胫骨全长X线照片，观察骨折两端的变化。使用X线机（XR656型，GE公司，美国）拍摄胫骨侧位X线片，摄片条件为：电压55 kV，电流 2 mA，曝光时间13 ms。

1.3.4 Micro－CT检查 将样本置于Micro－CT测试管内，沿标本长轴方向进行扫描，获取连续的Micro－CT 图像，扫描精度：8．52 μm，重建后分辨率：17．2μm，扫描电压：80 kV，电流 500μA，阈值：1 000，兴趣区：1 600，宽度：2 100。图像高斯滤波后，以骨折部位为中心进行三维重建。利用Inveon Research Wofkplace分析软件（SIMENS公司，德国）将得到的三维图像信息进行定量分析，计算样本骨痂的骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb．Th）、骨小梁数量（Tb．N）等。

1.3.5 组织学观察 取已置于10%中性多聚甲醛溶液中的患侧标本，25℃下固定1周。磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗后，将标本置于10%乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2，DEPC水配制）脱钙液中进行脱钙，直至组织软化为止。脱钙后用乙醇梯度脱水，使用二甲苯透明处理2 h，石蜡包埋。沿股骨干长轴切片，厚度为5μm，再行苏木精－伊红（HE）染色。所用液体试剂均需用DEPC处理或DEPC水配制。每份标本随机取6张胫骨切片，分别在光学显微镜下观察骨痂的生长情况。

1.3.6 免疫组化染色 石蜡切片烤片6～8 h后常规脱蜡，3%H2O2溶液室温孵育10 min后，枸橼酸盐缓冲液抗原热修复，滴加牛血清白蛋白（BSA）封闭液，滴加兔抗骨形态发生蛋白－2（BMP－2）多克隆抗体（博士德产品），4℃过夜，37℃复温1 h。滴加生物素二抗，室温30 min，滴加DAB显色剂显色，苏木素复染，封片镜检。

1.3.7 实时荧光聚合酶链反应（Real Time－PCR） 在mRNA水平上分别测定3组样本中BMP－2因子的表达量。Trizol法提取总RNA并测定总RNA浓度（OD260/280在 1．6～1．8）。采用反转录试剂盒和实时定量PCR试剂盒（TIANGEN产品），将总RNA反转录合成为cDNA并定量扩增。扩增条件为：预变性，95℃，1 min；变性，95 ℃，5 s；退火/延伸，58 ℃，15 s。循环数40次。内参基因为GAPDH。GAPDH引物序列：正义链：5’－GGTGCTGAGTATGTCGTGGA－3’，反义链：5’－TGCTGACAATCTTGAGGGAG－3’；BMP－2 引物序列：正义链：5’－CATCCACTCCACAAACGAGA－3’，反义链：5’－GTCATTCCACCCCACATCA－3’（上海生工合成）。采用2－ΔCt公式计算BMP－2的相对表达量。

1.4 统计学分析 使用SPSS 19．0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料用均数±标准差（x±s）表示。3组间比较采用单因素方差分析。Micro－CT 结果中药物浓度与 BV/TV、Tb．Th、Tb．N 的相关性分析采用Pearson相关分析。以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 X线观察骨痂形成 术后10 d，3组大鼠的骨折断端均可见骨痂形成。骨折端愈合尚稳定，部分标本骨折断端微动，经X线观察Su－280组骨折端愈合情况好于Su－140组及假干预组，Su－140组优于假干预组，见图1。

图1 大鼠胫骨X线检查结果Fig.1 Resultsof X-ray examination of tibia in rats

2.2 Micro－CT检查结果 术后第10天，3组大鼠BV/TV值差异比较有统计学意义（P＜0．01）。Su－140组和Su－280组ROI区域的BV/TV值均大于假干预组（P＜0．01）。Su－280 组 BV/TV 值大于 Su－140 组（P＜0．01）。Tb．Th3 组比较差异有统计学意义（P＜0．01）。Su－280 组与假干预组间差异有统计学意义（P＜0．01）。Su－280组与 Su－140 组间差异有统计学意义（P＜0．01）。Su－140 组与假干预组间差异无统计学意义（P＞0．05）。Tb．N3 组比较差异有统计学意义（P＜0．01）。Su－280 组与假干预组间差异有统计学意义（P＜0．01），Su－280 组与 Su－140 组间差异有统计学意义（P＜0．05），Su－140组与假干预组间差异无统计学意义（P＞0．05）。各组 BV/TV、Tb．Th、Tb．N 的数值与 Su 浓度呈现明显相关（P＜0．01），见表 1、图 2。

表 1 Micro-CT 结果（x±s）Tab.1 Resultsof Micro-CT（x±s）

图2 各组大鼠胫骨Micro-CT结果Fig.2 Micro-CT of tibial of rats in each group

2.3 组织学观察 镜下可见，假干预组的骨折端有纤维骨痂和软骨痂形成，但骨小梁较小，间隙较大，结构疏松，血管稀少。Su－140组和Su－280组的骨折端有较多的纤维性和软骨性骨痂，并在软骨痂边缘见到钙化，可见骨外膜下成骨。同时，大量骨小梁开始形成，骨小梁间隙内可见较多的毛细血管。Su－280组毛细血管尤其丰富，且骨小梁的方向开始向着与骨干纵向平行的方向生长，见图3。

图3 3组大鼠胫骨骨痂HE染色Fig.3 HEstaining of tibial callusof ratsin threegroups

2.4 免疫组化结果 3组结果镜下显示，在骨痂内软骨细胞的矿化区周围存在着BMP－2的分布区域，且随着干预药物浓度的增加，区域面积增大，BMP－2的表达增多。且同假干预组及Su－140组相比，BMP－2分布增多的Su－280组骨痂内软骨细胞的矿化区面积增大，骨小梁数量增多，并趋向沿胫骨干纵轴的方向排列，见图4。

图4 3组大鼠胫骨骨痂中BMP-2的表达（免疫组化染色，×100）Fig.4 Expression of BMP-2 in thetibial callus of the three groups(immunohistochemical staining,×100)

2.5 Real Time－PCR结果 BMP－2在mRNA水平的表达量显示，3组大鼠的组间差异有统计学意义（P＜0．05）。其中，Su－280 组 BMP－2 表达量（7 114．75±1 474．67）高于假干预组（3 228．56±187．86）和 Su－140 组（4 163．96±678．88），差异显著（P＜0．05），假干预组同 Su－140 组间差异不显著（P＞0．05），见表 2。

表2 BMP-2的Real Time-PCR结果Tab.2 Real Time-PCR resultsof BMP-2

3 讨论

意外创伤引发的骨折最近几年显著增多，骨折断端的快速愈合是减少骨折后并发症的关键所在。骨折愈合是骨组织完全再生的过程，其修复经过纤维骨痂、软骨骨痂至成熟的骨性骨痂阶段。骨折早期，在骨折断端与其周围形成血肿，富含大量生长因子，并吸引大量炎性细胞浸润以清除坏死组织，为骨折修复创造有利条件。BMP－2是唯一能够单独诱导间充质细胞向骨组织方向分化的生长因子，是骨组织形成过程中最关键的调节因子，具有诱导间充质细胞的迁徙、增殖、分化，最终导致软骨形成的作用[3]。传统的中医药治疗骨折有着悠久的历史，且安全、风险小、无手术创伤，填补了西医治疗骨折的弊端。本研究通过建立大鼠胫骨干骨折模型，骨折愈合过程中给予传统中药Su进行治疗，结果显示，在骨折愈合早期，Su促进了骨痂中BMP－2的表达，进而促进大鼠胫骨干骨折的早期愈合。

Su是天津医院临床常用院内制剂（津药制字Z20070616），由骨碎补、土鳖虫、续断、煅自然铜、刘寄奴、川芎、当归、三七粉、五加皮、木瓜、熟地黄、补骨脂、无名异、菟丝子、党参、黄芪、煅龙骨、白芍和桂枝19味药物组成。方中以骨碎补、续断、土鳖虫3味主药配合，补肝肾、强筋骨、破瘀血、续折伤，治疗骨折损伤、瘀滞疼痛，通过补肾气以达到主骨生髓、促进骨折愈合的目的，共为君药。该方剂以骨折三期治则为指导原则，从整体出发，舒筋活血，补肾壮骨[4－5]。现代研究将传统中医与分子生物学技术相结合，已证实活血化瘀能通过增强骨生长因子成纤维细胞生长因子（FGF）－2、血管内皮生长因子（VEGF）、BMP－2和转化生长因子（TGF）－β1等的表达促进骨折的愈合[6－12]。本研究通过现代分子生物学技术从微观探讨中药Su促进骨折早期愈合的机制。应用传统的骨影像学可观察到大鼠胫骨干骨折早期愈合的情况。经Micro－CT技术[13－14]重建了骨折断端骨痂的三维图像，并进行定量分析，得到了骨痂的相关形态学参数。在离体空间更精确地反映了骨痂形态和骨痂矿化的过程，明确了苏氏接骨胶囊对骨折早期愈合的影响深度及愈合程度对该方剂药物浓度的依赖性。同时，骨痂组织HE染色及免疫组化结果显示，同假干预组比较，给予中药灌胃治疗的实验组大鼠，其骨折断端的软骨细胞矿化区面积增大，骨小梁数量增多，血管更加丰富，分布于骨小梁间的BMP－2蛋白更为广泛。Real Time－PCR的定量检测结果显示，随着不同剂量中药的干预，在mRNA水平上，各组之间BMP－2的表达量存在显著的差异。BMP－2诱导成骨有3个条件[3]：首先，有效的BMP－2浓度；其次，存在BMP－2的靶细胞群；最后，正常的骨生长环境。本研究显示，BMP－2的表达量随着药物干预浓度的增加而增加，骨折愈合的也越好。这有可能是高剂量的BMP－2通过激活以下2个信号通路BMP－2/Smads/Runx2/Osterix或BMP－2/Smads/Msx2/Osterix来促进骨折的早期愈合。

综上所述，中药Su能促进大鼠骨折断端骨痂内BMP－2的生成及骨折的早期愈合，在分子生物学水平为中药治疗骨折愈合提供了有力的实验证据。