中药降糖复方对KK-Ay小鼠糖尿病肾病的影响*

洪金妮，王学美，富 宏，张 宁，黎巍威

(北京大学第一医院中西医结合研究室，北京 100034)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种由于胰岛素分泌不足和/或作用缺陷引起的以慢性高血糖为特征的代谢性疾病[1]。糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常见的慢性微血管并发症之一，近年来在我国发生率高达25%～40%[2]，但治疗手段十分有限。中药降糖复方是北京大学第一医院中西医结合科王学美教授在临床上治疗2型糖尿病的常用方，具有清热活血、益气养阴的功效。本课题组前期通过单中心随机对照临床研究证实，中药降糖复方可有效降低患者空腹及餐后血糖[3]，减少西药服用量，有效降低糖尿病模型小鼠KK (KK-Ay小鼠)尿蛋白，改善肾小球细胞和基质增生等病变，减少糖基化终末端产物及氧化应激[4]，激活磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3 kinase, PI-3 K) / 蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)的信号通路，抑制核因子κB(NF-κB)的信号通路，降低炎症反应[5]，改善糖尿病症状。但中药降糖复方是否具有改善KK-Ay小鼠血糖、血脂及肾功能的作用有待进一步研究。本文通过研究中药降糖复方颗粒剂对KK-Ay小鼠血糖、血脂、尿液生化、肾脏病理等影响，探讨其对2型糖尿病引起的糖尿病肾病的疗效及作用机制，对中药复方的进一步开发提供思路。

1 材料

1.1 动物

雄性自发性2型糖尿病模型KK-Ay小鼠50只，9周龄，北京华阜康生物科技股份有限公司(许可证编号SCXK(京)2014-0004)；健康雄性C57BL/6 J小鼠10只，9周龄，北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证编号SCXK(京)2012-0001)。KK-Ay小鼠高脂饲料饲养，北京华阜康生物科技股份有限公司(许可证编号SCXK(京)2014-0008)；C57BL/6 J小鼠普通饲料饲养。所有动物自由饮水，在室温(22±1)℃、12 h光照周期SPF环境中适应性饲养1周。尾尖取血测KK-Ay小鼠餐后血糖(postprandial blood sugar，PPBS)≥11.1 mmol·L-1或空腹血糖(fasting blood glucose， FBG)≥7.0 mmol·L-1即视为糖尿病模型。

1.2 药物

地锦草(Humifuseeuphorbiaherb)、丹参(Salviamiltiorrhiza)、生黄芪(RawRadixAstragalis)、知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)、黄连(RhizomaCoptidis)颗粒剂均购自北京康仁堂药业有限公司，药物比例为3∶4∶2∶2∶1，用双蒸水配置成生药浓度为0.2 g生药·mL-1、0.4 g生药·mL-1和0.8 g生药·mL-1备用。取盐酸二甲双胍(中美上海施贵宝制药有限公司)1 g溶于40 ml 双蒸水中，制成25 g·L-1的阳性给药液，灌胃体积均为0.01 ml·g-1/体质量。

1.3 试剂及仪器

精蛋白锌重组人胰岛素注射液(中效型，优泌林，美国礼来公司)；甘油三酯测定试剂盒(GPO-PAP法，中生北控生物科技股份有限公司)；总胆固醇测定试剂盒(COD-PAP法，中生北控生物科技股份有限公司)；尿素氮测试盒(南京建成生物工程研究所)；肌酐测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；尿蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；小鼠糖基化终末端产物(advanced glycation end products，AGEs)检测试剂盒(Abbexa，批号L201610A346)；小鼠糖基化终末端产物受体(receptor of glycation end products，RAGE)检测试剂盒(R&D)；罗康全卓越型血糖仪(瑞士罗氏公司，批号P103593)；infinite M200酶标仪(瑞士TECAN公司)；VELOCITY-18R型离心机(澳大利亚 Dynamica公司)；MB100-2 A型微孔板恒温振荡器(杭州奥盛仪器有限公司)；ES-1100(长沙湘平科技发展有限公司)。

2 方法

2.1 分组及给药

将KK-Ay小鼠按随机数字表法分为模型组、二甲双胍组、中药低浓度组、中药中浓度组和中药高浓度组5组各10只，以C57BL/6 J小鼠为正常对照组。其中二甲双胍组灌胃盐酸二甲双胍(250 mg·kg-1/体质量)，中药低浓度组、中药中浓度组、中药高浓度组分别按2 g·kg-1/体质量、4 g·kg-1/体质量、8 g·kg-1/体质量灌胃中药降糖复方颗粒剂，正常对照组和模型组灌胃等体积蒸馏水，每日1次共12周。

2.2 检测方法

2.2.1 血糖检测及口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test，OGTT) 餐后血糖：在小鼠不禁食的情况下，于给药0周、4周、8周、12周时的固定时刻尾尖采血10～20 μl，采用葡萄糖氧化酶法检测；口服葡萄糖耐量试验：小鼠禁食4 h，尾尖取血测血糖，灌胃高浓度葡萄糖0.2 g·ml-1(2 g·kg-1/体质量)，0 min(FBG)、30 min(BG30)、60 min(BG60)、120 min(BG120)时间点测血糖绘制血糖曲线，计算曲线下面积AUCg=(FBG+BG30)×0.5÷2+(BG30+BG60)×0.5÷2+(BG60+BG120)×0.5÷2。OGTT在给药0周、4周、8周、12周检测共4次。采用葡萄糖氧化酶法检测血糖。

2.2.2 血生化检测 小鼠禁食4 h尾尖取血，检测甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、血清肌酐(Cr)、血清尿素氮(BUN)。甘油三酯采用甘油磷酸氧化酶-过氧化物酶(GPO-PAP)检测法，总胆固醇采用胆固醇氧化酶-过氧化物酶(COD-PAP)检测法，血清肌酐采用肌氨酸氧化酶法，血清尿素氮采用脲酶法检测，均按照相关说明书操作。在给药0周、4周、8周、12周时检测共4次。

2.2.3 尿样收集及检测 将小鼠放入小鼠代谢笼饲养24 h，并收集24 h尿量，共收集500～1000 ml尿液，4500 r·min-1离心10 min，-80 ℃冻存。在给药0周、4周、8周、12周放入代谢笼共4次。用相应试剂盒检测尿肌酐、尿素氮、尿蛋白，分别采用肌氨酸氧化酶法、脲酶法、考马斯亮蓝(CBB)法。

2.2.4 肾脏病理检查 灌胃12周后，将小鼠空腹8 h后处死，取小鼠一侧肾皮质放置于10%中性甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，制成3 μm石蜡切片，HE染色后采用OLYMPUS DY07显微镜观察肾脏形态学变化。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 中药降糖复方对KK-Ay小鼠血糖的影响

3.1.1 空腹血糖 表1显示，中药降糖复方能明显改善KK-Ay的空腹血糖。所有入选KK-Ay小鼠均已成模，模型组血糖在造模成功后一直处于高血糖状态。与模型组比较，给药4周后所有给药组均能降低血糖，但差异无统计学意义；给药8周后，二甲双胍及低中浓度组能明显改善小鼠空腹血糖(P<0.001)，其中中药低中浓度组效果优于高浓度组；给药12周后，二甲双胍及所有中药组能明显改善小鼠空腹血糖(P<0.01)，低中浓度组的血糖低于高浓度组，但降糖效果次于阳性药组。

表1 中药降糖复方对KK-Ay小鼠空腹血糖的影响

注：与模型组比较：1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001

3.1.2 餐后血糖和口服葡萄糖耐量试验 表2显示，中药降糖复方能明显改善KK-Ay的餐后血糖和口服葡糖萄糖耐量。与模型组比较，给药4周后二甲双胍及所有给药组均能明显改善小鼠餐后血糖(P<0.01)；给药8周、12周后，各给药组均能有效降低小鼠餐后血糖，且中药各给药组降低血糖的效果优于二甲双胍组，低浓度组效果最明显。给药12周后，与模型组比较中药低中高浓度组降低口服葡糖糖耐量试验曲线下面积差异有统计学意义(P<0.05)，低浓度组效果最明显(P<0.001)。

表2 中药降糖复方对KK-Ay小鼠餐后血糖、口服葡糖糖耐量曲线下面积的影响

注：与模型组比较：1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001

3.2 中药降糖复方对KK-Ay小鼠肾功能影响

表3显示，中药降糖复方能在一定程度改善小鼠肾功能。与对照组比较，模型组血清和尿液中的BUN、Cr及尿蛋白水平均有所上升。与模型组比较，给药12周后二甲双胍及各给药组均能在一定程度上降低血清中的BUN和Cr，其中中浓度组和高浓度组降低血清中BUN差异有统计学意义(P<0.05)，高浓度组降低血清中Cr更为显著(P<0.05)；给药12周后二甲双胍及各给药组均能降低尿液中的BUN、Cr和尿蛋白，与模型组比较，中浓度组和高浓度组降低尿中Cr和尿蛋白差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 中药降糖复方对KK-Ay小鼠肾功能的影响

注：与模型组比较：1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001

3.3 中药降糖复方对KK-Ay小鼠血脂和尿液、饮水、摄食量的影响

表4显示，中药降糖复方能改善KK-Ay小鼠甘油三酯和总胆固醇，低、中浓度疗效较佳。与对照组比较，模型组TG和TC明显上升。与模型组比较，给药12周后二甲双胍及中药低、中浓度组能在一定程度上降低小鼠血脂，其中中浓度组降低TC差异有统计学意义(P<0.01)。复方还能改善小鼠的多饮多食多尿症状。给药12周后，二甲双胍组及中药低浓度组能显著减少小鼠尿量(P<0.05)；二甲双胍组及各给药组能在一定程度上减少小鼠摄食量和饮水量，且成一定的浓度依赖性。

3.4 中药降糖复方对小鼠血清中AGEs和RAGE的影响

表5显示，中药降糖复方能降低KK-Ay小鼠血清中糖基化终末端产物(advanced glycation end products，AGEs)及糖基化终末端产物受体(receptor of glycation end products，RAGE)的沉积。给药12周后，与模型组比较中药中、高浓度组能显著降低小鼠血清中AGEs含量(P<0.05)，效果优于二甲双胍组；给药12周后，二甲双胍组及中药中、高浓度组能显著降低小鼠血清中RAGE含量(P<0.01)。

表4 灌胃12周后中药降糖复方对KK-Ay小鼠TG、TC、尿量、摄食量及饮水量的影响

注：与模型组比较：1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001

表5 灌胃12周后中药降糖复方对KK-Ay小鼠血清中AGEs及RAGE的影响

注：与模型组比较：1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001

3.5 HE染色观察中药降糖复方对肾脏影响

图1显示，中药降糖复方能在一定程度上改善糖尿病肾病小鼠肾脏的组织形态学病变。通过HE染色，可观察到模型组中肾小球毛细血管扩张，充满大量红细胞(虚线箭头)，肾小囊内血浆蛋白大量渗出，肾小球系膜细胞增生。而正常组和给药组可见肾小球结构相对正常(实线箭头)，肾小球形态规则，肾小囊壁层均匀，细胞排列整齐，堆积聚拢现象较少，肾小球系膜细胞增生较轻，肾小球毛细血管无或轻度扩张，偶尔可见少量红细胞(虚线箭头)，肾小囊内血浆蛋白渗出较少或无。从图中可见，用药后，肾小球毛细血管扩张情况明显好转，红细胞和血浆蛋白溢出明显减少。

图1 灌胃12周后中药降糖复方对KK-Ay小鼠肾脏HE染色的影响(n=10)

4 讨论

糖尿病肾病是糖尿病最常见的并发症之一，是导致肾衰竭的首要原因。AGEs途径是糖尿病的经典发病学说。AGEs是持续高血糖状态下，葡萄糖与各种蛋白质结合非酶糖基化反应形成的终末产物。近年来研究认为，AGEs在肾脏局部堆积可通过多种直接和间接途径参与糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy, DN)的发生发展[3]。AGEs与RAGE结合能改变蛋白结构功能，降低酶活性，引起基质蛋白交叉连接，导致肾脏细胞功能、组织结构异常；另一方面，二者结合后可激活NF-κB信号通路引起炎症因子释放，损伤肾脏组织。在糖尿病患者的肾脏中，AGEs的大量聚集刺激系膜细胞表面的AGEs受体，使层黏连蛋白及其他肾小球系膜结构蛋白明显增加，最终致系膜区扩张，肾小球基膜增厚，加速肾小球硬化[4]。

糖尿病肾病的治疗手段十分有限，主要通过控制饮食、血糖血脂血压等延缓疾病进展。近年来随着研究的深入，有学说认为糖尿病肾病是一种炎症性疾病[6-7]。有研究报道[8]，清热解毒中药可以改善糖尿病肾病症状、降低血糖、改善微循环、保护肾功能，其作用机制可能与抑制炎症反应因子、糖基化终末产物、影响肾素血管紧张素系统、改善脂代谢紊乱等有关。近年来，随着2型糖尿病临床研究和分子生物学炎症机制研究的不断深入，其“热毒”病机与清热解毒治法在临床中的应用得到重视。而刘完素[9]、张从正[9]、郭士魁[10]、施今墨[11]、祝谌予[12]等大家也均重视应用清热解毒法治疗糖尿病。

中药降糖复方以“热毒”立论，采用地锦草、黄芪、黄连、丹参、知母等中药组方配伍成清热活血、益气养阴的方剂，其中地锦草性平、味辛微苦涩，善清热解毒、利湿降浊具有活血凉血之效，与黄连共为君药；丹参活血化瘀、清心除烦可辅君药化瘀降浊为臣；黄芪补脾益气，知母清热养阴共为佐使。近年来，众多单味药、单体被证实能有效防治糖尿病及其并发症。研究发现，地锦草能有效改善KK-Ay的空腹血糖和胰岛素抵抗[13]；丹参的主要成分丹酚酸B能提高胰岛B细胞数量，改善胰岛结构和功能[14]；黄芪能降低血糖，改善口服葡萄糖耐量和胰岛素抵抗[15]；知母能改善2型糖尿病大鼠的血糖血脂水平[16]；黄连能改善葡萄糖的非酶促糖基化反应，二羟基化合物的形成以及糖基化终末端产物的形成[17]。

本研究通过动物实验观察中药降糖复方颗粒剂对自发糖尿病KK-Ay小鼠血糖、血脂、尿液、饮食、饮水量、肾脏形态学等的影响。实验结果显示，中药降糖复方颗粒剂能在一定程度上改善KK-Ay小鼠空腹血糖、餐后血糖、口服葡萄糖耐量、血清和尿液中肌酐、尿素氮等相关指标，同时通过HE染色发现，中药降糖复方能在一定程度上缓解肾小球毛细血管扩张、肾小囊内血浆蛋白渗出等组织形态学，证实中药降糖复方能改善糖尿病肾病。进一步实验发现，中药降糖复方能降低小鼠血清中AGEs和RAGE，提示中药降糖复方颗粒剂可改善KK-Ay小鼠糖尿病肾病的机制可能与降低体内AGEs和RAGE有关。中药降糖复方可能通过降低血糖，减少葡萄糖与蛋白质发生非酶促糖基化反应，直接或间接减少AGEs的沉积，从而改善糖尿病肾病，其具体机制有待进一步研究。