表观遗传修饰与胚胎着床

马妮，张昌军，3，刁红录，3*

表观遗传学是指在不改变DNA序列的前提下研究基因在转录能力及表观遗传性方面的变化[1]。在哺乳动物胚胎发育过程中父系和母系基因组必须经历表观基因重塑及转录模式的改变从而才能促进胚胎的正常发育。在受精过程中雌、雄配子各自表达其表观遗传特异型，受精卵是一种比较独特的细胞，因为它有从一个细胞分化发育为任何一种组织的能力，为了实现多能性，生殖细胞的表观遗传经历重设后胚胎基因组必须被转录因子在空间状态下被高度修饰。胚胎着床同样需要呈现接受态的子宫才能保证胚胎的顺利植入，影响子宫内膜接受态的形成因素众多，以下我们主要介绍表观遗传修饰在胚胎发育及着床过程中的影响。

一、表观遗传学与胚胎发育

表观遗传学修饰包括组蛋白修饰、DNA甲基化、基因印记、非编码RNA和X染色体失活等[2]。现在研究主要集中于组蛋白修饰和DNA甲基化与胚胎发育的关系，首先简要介绍表观遗传修饰在胚胎发育中的作用。

1.组蛋白修饰与胚胎发育

在真核生物中，染色体内DNA和组蛋白结合所形成的染色质中有一个重复的核小体单位，它是由146对碱基缠绕八个组蛋白后卷曲和压缩后形成的[3]。核心组蛋白包括H2A，H2B，H3和H4，连接组蛋白包括H1和H5，核心组蛋白形成组蛋白的核心，连接组蛋白是连接DNA的。组蛋白有多种转录后修饰包括组蛋白上一些氨基酸乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等修饰[4]。组蛋白氨基酸末端突出于核小体表面，为了基因的转录它必须从物理结构上发生改变使DNA可以容易或者不容易结合转录因子从而实现基因的表达。

(1)组蛋白乙酰化与胚胎发育：在胚胎着床前组蛋白不同残基发生乙酰化修饰在胚胎发育时间窗中对染色质重构有重要的作用，H3不同残基乙酰化在胚胎着床前的变化是不同的，在胚胎卵裂时可以检测到H3K64ac，H3K56ac的丰富表达，但是H3K122ac仅有微弱的表达，说明不同组蛋白修饰在胚胎早期发育中发挥的作用不同[5]。蛋白修饰中研究最多的是组蛋白乙酰化，乙酰化后组蛋白与DNA结合疏松，这样有利于DNA与转录因子的结合，相反，组蛋白去乙酰化使组蛋白与DNA紧密结合不利于基因的转录，这两种状态是由组蛋白乙酰化转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)相互作用而达到生物学平衡[6]。组蛋白乙酰化可以诱导DNA复制和转录，HDAC1可以影响小鼠胚胎的发育，如果在胚胎发育早期缺乏HDAC1就会使胚胎发育延迟或停止[7]。

(2)组蛋白甲基化与胚胎发育：组蛋白翻译后修饰被广泛研究，例如在胚胎基因组激活中H3K9me3和H3K27me3被认为是转录活性的一种抑制性标志，而H3K4me3、H3K36me3和H3K9ac被认为是转录活性的一种激活性标志[8]。在早期发育的胚胎中H3K4me3高表达且表达于父系基因组[9]，而胚胎发育为1细胞到4细胞是胚胎基因激活期，H3K4me3是从配子融合形成胚胎开始出现的，在受精卵中表达降低，随后在胚胎发育为2细胞时表达升高直至囊胚期[8]。在母系基因组及卵母细胞中发现有一种非经典的H3K4me3(nc H3K4me3)存在，并可以与大部分DNA甲基化区域重复，在2细胞胚胎时经典H3K4me3开始建立而nc H3K4me3的表达慢慢消失，说明在胚胎发育早期H3K4me3在父系基因组和母系基因组都发挥一定的生物学功能，与DNA甲基化有一定的联系并且在哺乳动物早期发育中是动态变化的[9]。在胚胎发育过程中的囊胚期前H3K27me3表达较囊胚期后低，说明H3K27me3在分化的细胞中表达高于分裂细胞，可能的原因是多能性基因的启动子处被甲基化而无法转录[10]。

合子基因激活(ZGA)主要发生在1细胞和2细胞阶段，这对正常个体的发育是非常重要的，胚胎植入前基因激活(MGA)主要发生在4细胞到8细胞阶段，转录因子主要在这个阶段开始表达并调控内外胚层的发育[11]。CHD1(chromodomain helicase DNA binding protein 1)是ATP酶依赖性染色质重塑因子家族的成员，它可以使H3K4三甲基化，并促进mRNA的转录，对维持小鼠胚胎干细胞多能性必不可少[12]。在外胚层发育过程中CHD1可以促进基因转录使外胚层快速发育，如果敲除Chd1基因后小鼠胚胎就会在第6.5天的时候因为外胚层发育障碍而停止发育[13]。在小鼠胚胎中敲除Chd1基因后会使植入的胚胎死亡，有研究认为，在小鼠胚胎早期发育中如果抑制Chd1基因的转录因子Pou5f1、Nanog和Cdx2，基因激活(MGA)就开始急剧下降，而调节以上转录因子的Hmgpi和Klf5在ZGA期被显著抑制，Hmgpi的表达被抑制直至囊胚期，而Klf5的表达抑制在桑葚胚期被解除，说明在基因激活阶段主要是通过Hmgpi和Klf5调节转录因子而影响CHD1的表达进而控制小鼠胚胎的发育与存活[13]，还有研究认为，CHD1通过改变染色体结构而影响基因的表达，说明CHD1对于小鼠早期胚胎的正常发育必不可少。

在核心组蛋白中H2A是变化最多的一种核心蛋白，而在H2A中H2A.Z是研究最多的一种，H2A.Z是最先发现与哺乳动物发育有密切关系组蛋白变体，虽然其序列高度保守，但是它在不同生物中扮演的角色不同。H3K36me3可能与基因转录延长有关，H3K36甲基化转移酶通过Rbp1最大的亚基CTD与RNA聚合酶II相互作用影响基因转录[14]。早期胚胎发育的特点是细胞的多能性和染色质结构的动态变化，在小鼠胚胎发育为2细胞阶段，H2A.Z乙酰化水平和H3K36me3表达水平下降，2细胞胚胎为胚胎基因组主要的激活时间(在牛胚胎发育时胚胎基因组激活时间为8细胞阶段)，说明这些活性标志与胚胎基因组转录激活有关系，如果小鼠缺乏H2A.Z会使胚胎内细胞团增殖和分化有缺陷而导致胚胎着床前死亡[15]。

2.DNA甲基化与胚胎发育

DNA甲基化是DNA复制后的一个共价修饰调节，一个甲基化基团结合到核苷酸的CpG岛处(位于鸟嘌呤后的胞嘧啶)，它作为DNA和转录因子之间的物理屏障，或者吸引酶和蛋白从而减少转录因子和DNA之间的结合[16]。

DNA甲基化转移酶(DNMTs)对促进DNA甲基化必不可少，一旦DNA序列被甲基化那么就会有一些蛋白识别甲基化的胞嘧啶并使染色质重塑从而抑制基因转录，与组蛋白修饰一样，DNA甲基化转移酶对于胚胎的正常发育必不可少，DNA甲基化在胚胎着床前也会发生一系列变化，成熟的精子和卵母细胞中DNA都被高度甲基化几乎没有转录活性，在内细胞团中DNA甲基化水平高于外胚层，说明甲基化可以调节基因转录活性，影响细胞的多能性及分化能力[17-18]。在人类辅助生殖技术中发现异常胚胎和冷冻胚胎中DNMTs的表达比新鲜胚胎中低，说明异常发育和低温保存可能影响胚胎中DNMTs的表达[19]。在哺乳动物中最常发生的DNA甲基化是在DNA结构中第5个键发生甲基化(5mC)，尽管在小鼠卵母细胞中发现非CpG甲基化水平表达显著但是其功能未知，5mC的作用在各个方面研究较多，在哺乳动物发生发育过程中，DNA甲基化是表观遗传作用中比较重要的一种修饰，当细胞分化发育为不同谱系时5mC将会引导细胞分化并作为一种障碍阻止其向未分化细胞分化[20]。

3.基因印记与胚胎发育

是指来自父系或母系的等位基因在子代中有不同的表达方式。在父系基因印记中父系等位基因被表观遗传修饰而不发生转录，这样就会使在子代中只有单母系等位基因的表达；而在母系印记基因中，母系等位基因被表观遗传修饰而不发生转录，这样就会使在子代中只有单父系等位基因的表达，基因印记通常被组蛋白修饰[21]。哺乳动物每次生殖周期中配子将会重新建立印记基因，在受精后的第11.5天原始生殖细胞将会发生去甲基化以抹去遗传父母的印记，在第13天印记被完全抹去后会根据胎儿性别等特征重新发生基因印记[22]。

4.非编码RNA与胚胎发育

非编码RNA是指不翻译成蛋白即不参与基因转录的RNA，包括很多种如snRNA、snoRNA、microRNA，主要功能是参与DNA转录后表达的调节，非编码RNA中当前研究最多的是miRNA，它主要是结合到mRNA序列上阻止其翻译从而抑制DNA的表达[23]。在早期胚胎中发现母系遗传的miRNA相当丰富，小鼠胚胎2细胞阶段时miRNA的表达明显升高[24]，在小鼠胚胎发育中如果缺乏Dicer酶(是RNAi发挥作用过程中重要的物质)那么miRNA将无法发挥作用，这样就会减少小鼠胚胎干细胞的数量，说明miRNA可以维持干细胞的多能性，参与胚胎的发育[25]。

5. X染色体失活与胚胎发育

在女性胚胎中有2条X染色体，其中将会随机选择一条失活，而参与X染色体失活的表观遗传包括不同的组蛋白修饰和DNA甲基化，它可以参与胚胎干细胞多能性的维持[26]。

二、表观遗传修饰与子宫内膜容受性

子宫内膜容受性是胚胎着床和成功妊娠的先决条件，子宫内膜接受态的形成包括很多复杂的转录过程，该过程由雌孕激素以及众多分子的相互作用完成的，其中一些精细调节是由表观遗传修饰所调控的。容受性的子宫内膜是一种正常的生理状态，它主要是为胚胎顺利着床做准备，在人类、小鼠和牛的发情周期中子宫内膜变化都涉及以上分子的表达[27]，体内和体外产生的胚胎分别在形态、功能和转录水平都有差异，它们成功植入需要激活子宫内膜不同的基因和转录调节机制，这些调控可能是通过基因的表观遗传学实现的。

在月经周期中，子宫内膜发生蜕膜化(子宫内膜基质细胞形态和功能上的改变)对于其接受态的形成和胚胎植入必不可少，而表观遗传修饰可能影响月经周期中子宫内膜相关基因的表达从而导致基质细胞发生蜕膜化，异常的表观遗传修饰可能会导致蜕膜化异常影响胚胎植入。体外表观遗传修饰HDAC(修饰组蛋白去乙酰化)参与月经周期的变化，HDAC抑制剂Trichostatin A(TSA)作用于子宫内膜后可使上皮细胞凋亡、基质细胞发生形态学变化及蜕膜化标志蛋白的表达，例如：胰岛素样生长因子(IGFBP-1)、催乳素等都可以促进基质细胞发生蜕膜化[28]，在蜕膜化中发现H3、H4发生乙酰化并且H4乙酰化与卵巢类固醇激素密切相关可以激活IGFBP-1的启动子[29]。DNA甲基化可以调节一些与子宫内膜接受态相关基因的表达，例如可以使Cdh1，Pgr，Esr，Lif等基因启动子处甲基化，影响子宫内膜接受态的形成[30]。有研究认为E-cadherin对于子宫内膜接受态的形成至关重要，而它的表达又受到DNA甲基化转移酶的调节，单独抑制DNMT-1、-3A、-3B分子后对E-cadherin的表达无影响，但是联合抑制三种DNMT-1、-3A、-3B分子后就会使E-cadherin的表达上升并促进子宫内膜向接受态转变，说明了不同价甲基化转移酶均参与了子宫内膜接受态的形成[31]。

在细胞分化发育过程中PRC1可以调节一些基因的表达，多梳抑制复合体1(Polycomb repressive complex 1，PRC1)成员(Cbx2、Cbx4、Ring1B和Rybp)可以调节组蛋白修饰(H3K27me3和H2AK119ub1)影响子宫组织蜕膜化中多倍体的发育，在小鼠胚胎着床前体外注射PRC1抑制剂PRT4165后观察小鼠胚胎着床情况，发现药物处理组和对照组无明显的区别，说明PRC1对于胚胎与子宫黏着的影响较小，但是发现在PRT4165处理后小鼠早期妊娠蜕膜化中的多倍体形成被破坏[32]。

miRNA是重要的转录调节者可以编码高度进化的RNAs，长度大约有22个核苷酸，可以通过降解或抑制目标mRNA的表达，也是子宫内膜容受性的潜在调节者，miRNA-mRNA调控系统与胚胎着床有关，有研究认为miR-30b，miR-30d，miR-494在子宫内膜容受性形成过程中发挥着重要的作用，在接受态的子宫内膜中miR-30b，miR-30d高表达，而miR-494和miR-923低表达，miRNA在调节子宫内膜接受态形成过程中通过不同的途径参与其中，例如Wnt信号通路、轴突传导信号、ERK/MAPK信号通路、TGF-β信号通路、p53信号和白细胞外渗信号传导途径等[33-34]。

几种良性的妇产科疾病如子宫内膜异位症、子宫肌瘤、输卵管积水、多囊卵巢综合征等都可以导致生殖能力下降和影响子宫内膜接受态的形成，而DNA甲基化转移酶与组蛋白乙酰化修饰可以影响胚胎植入相关基因的表达，例如LIF、HOXA10等[35]。在上面所提的几种疾病中都发现在胚胎着床窗口期的内膜中HOXA10(孕激素作用的靶基因)的表达较正常降低，有研究认为在子宫内膜异位症当中DNA甲基化转移酶表达升高，它可以沉默HOXA10的启动子使HOXA10的表达下降，HOXA10的缺乏可以导致胚胎着床失败和子宫内膜接受态的形成受阻[36]。有研究认为在胚胎植入子宫的过程是HOXA10调控的两个过程，第一个过程是胚胎着床前HOXA10高表达有利于基质细胞转变为蜕膜化细胞，第二个过程是蜕膜化细胞中HOXA10的表达下降有利于胚胎的浸润，研究认为在滋养层细胞中LIF和IL6大量产生后以旁分泌的形式刺激STAT3和MMP的产生以降低HOXA10的表达，STAT3和MMP的高表达有利于促进滋养细胞向子宫内膜的浸润[37]。 所以可以认为表观遗传修饰中的DNA修饰 、组蛋白修饰、非编码RNA参与子宫内膜蜕膜化的形成对子宫内膜接受态的形成有重要的作用。

三、展望

尽管在哺乳动物着床前基因的转录序列已经被确认，但是理解分子的相互作用可以更好的认识在胚胎着床前转录的进行。精子和卵母细胞发育并形成受精卵的过程中它们各自的基因高度甲基化后发生转录沉默，这就保持了受精卵的全能性，受精卵发育过程中基因发生表观遗传修饰后又恢复了转录活性，从而行使生物学功能。哺乳动物精卵融合过程中原始生殖细胞发生时间和空间的表观遗传修饰，DNA修饰和染色质修饰决定哪些基因区域先开放发生转录，哪些先关闭发生沉默。但是有关表观遗传学在哺乳动物生殖，尤其是在子宫内膜容受性建立的过程还需深入探索，这样才会更好地为辅助生殖技术提供理论基础，才能提高妊娠率，造福于人类不孕不育事业。