应用酸化力法评估酱油中酵母的活力

童星, 彭勃

(1.佛山市海天(高明)调味食品有限公司，广东 佛山 528511；2.佛山市海天调味食品股份有限公司，广东 佛山 528000；3.广东海天创新技术有限公司，广东 佛山 518064)

酵母菌在酱油发酵过程中具有重要的意义，是酱油酿造后期风味物质的来源[1]，其中鲁氏酵母具有较高的耐盐性，是目前酱油产业中最常见的产香菌株[2,3]。随着高盐稀态酱油工艺的推行，常常将鲁氏酵母等耐盐产香酵母以人工培养液的形式添加到酱醪中，从而改善酱油酿造中风味的单一性，提高酱油的风味质量[4]。因此，酵母添加液中菌株的活力就成为了酱油风味品质和生产稳定性的重要支撑之一。

目前在酱油的发酵研究中，人们通常以镜检总酵母数作为评价酵母培养液质量的常规指标，然而日常检测中发现当酵母培养液在稳定期时该指标波动较少，无法准确预判酵母添加到酱醪后的酒精发酵能力。而亚甲基蓝染色法、镁离子释放法以及平板涂布计数等检测方法的操作相对复杂，检测周期较长，不利于在生产应用中广泛推广[5]。酸化力法是检测酵母活力的一种简单有效的方法，其原理为酵母细胞在培养液中葡萄糖含量提高时，能够通过葡萄糖降解促进质子泵出细胞外以维持调整胞内的pH稳定[6]，从而会引起发酵液中pH值的变化，这种变化与酵母的活性及其发酵性能密切相关[7,8]，是评价酵母活性的有效方法之一[9]。

酸化力法最先被应用于啤酒酵母的活力评价[10]，继而有其适用于工业酒精酵母的报道[11]，本文通过从天然酱醪中筛选出鲁氏酵母作为实验菌株，研究酸化力法对该菌株活力的检测效果，并对其影响因素进行稳定性探究，最终表明酸化力法能够高效、可靠地检测出酱油中鲁氏酵母的发酵活力，在酱油发酵产业中具有潜在的应用价值。

1 材料与方法

1.1 菌种与试剂

鲁氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)：从天然发酵酱醪中分离获得。

酵母培养基：无水葡萄糖5%，酵母提取物1%，磷酸氢二钾0.5%，酱醪汁10%，氯化钠10%，pH 5.5，1×105Pa灭菌20 min。

无水葡萄糖、氯化钠、磷酸氢二钾(均为分析纯)：国药集团化学试剂有限公司；酵母提取物(生化试剂)：广东环凯微生物科技有限公司；亚甲基蓝(分析纯)：上海埃彼化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SHP-250型生化培养箱、WBK-6B型电热恒温水浴锅 广东环凯微生物科技有限公司；BX53型光学显微镜 日本Olympus公司；紫外分光光度计 上海棱光技术有限公司；2k15型冷冻高速离心机 Sigma公司；PB-10型pH计、BS323S型电子天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 酵母泥的制备

实验室酵母扩培，4000 r/min离心后取沉淀菌体，再用蒸馏水洗涤2次后得酵母泥。

1.3.2 酵母酸化力的检测[12]

称取洗涤离心后的酵母若干放到玻璃烧杯内，加入50 mL蒸馏水，搅拌，使酵母悬浮，10 min后检测pH值(pH10)；加入5 mL葡萄糖，再放置搅拌10 min后检测pH值(pH20)，测定在20 ℃下进行。GIPE值通过下式计算：GIPE= pH20-pH10。

1.3.3 菌体浓度的测定

将菌悬液适当稀释，用可见分光光度计于600 nm下测定吸收值(OD600)。用相同稀释倍数的空白培养基作对照，扣除对照中固形物的吸收值，OD600=OD600读数×稀释倍数。

1.3.4 总酵母数与酵母死亡率的测定

总酵母数的测定采用血球计数板法，死亡率的测定采用亚甲基蓝染色法[13]。

1.3.5 发酵实验

当酱醪pH降至5.2～5.3时添加酵母培养液，添加量1%，分别在添加酵母培养液后第7天和第14天后测定其酒精度。

1.3.6 酒精度测定

酒精度的测定按GB/T 10345-2007《白酒分析方法》。

2 结果与分析

2.1 酸化力法对鲁氏酵母活力的评价条件

2.1.1 酵母泥浓度对酸化力测定的影响

图1 不同酵母泥浓度对酸化力的影响Fig.1 Effects of yeast slurry concentration on acidification power

初定加入葡萄糖的浓度为5%，在室温下进行检测，研究不同酵母泥浓度对酸化力的影响。由图1可知，在酵母泥浓度为0～8%(W/V)时，随酵母泥浓度增加，GIPE值逐渐增大，其中在0～4%范围内GIPE值有较大的增幅。当酵母泥浓度在8%以上时，GIPE值趋于稳定，因此选定8%为酸化力法的酵母泥测量浓度。

2.1.2 葡萄糖浓度对酸化力测定的影响

图2 不同葡萄糖浓度对酸化力的影响Fig.2 Effects of different glucose concentration on acidification power

由图2可知，不加入葡萄糖的空白对照，pH不发生变化，证明不存在底物对实验结果的干扰作用。随着葡萄糖浓度的增加，GIPE值逐渐增大，在0～1%时增加速度最大。当葡萄糖浓度大于5%后，GIPE值缓慢增加，超过10%后GIPE值变化趋于平稳。综合考虑，确定酸化力法的最适葡萄糖浓度为10%。

2.1.3 检测温度对酸化力测定的影响

图3 不同温度对酸化力的影响Fig.3 Effects of different temperatures on acidification power

由图3可知，在0～30 ℃范围内，随测定温度的升高，GIPE值升高，可见酵母降解葡萄糖的速度在一定范围内与温度呈正相关。然而温度高于30 ℃后，GIPE值开始出现下降趋势，这与酵母对温度的耐受性有关[14]，因此酵母酸化力测试的最佳温度为30 ℃。

经优化实验后，确定酵母泥浓度8%，葡萄糖浓度10%，测定温度30 ℃为酸化力法测定鲁氏酵母活力的最适条件，将该条件应用于后续实验中。

2.2 酸化力法评价鲁氏酵母活力的可行性

2.2.1 不同活性酵母的酸化力评价

酵母的GIPE值依赖于位于质膜上的ATP酶质子泵活性，通过葡萄糖降解促进质子的流出，而死亡细胞的细胞膜及膜的机能遭到破坏，ATP酶也遭到破坏。通过60 ℃水浴保温2 h后制得死细胞，将不同比例的培养至稳定期的酵母活细胞和死细胞进行混合处理，测定其酸化力，见图4。

图4 不同活细胞比例酵母的酸化力Fig.4 The acidification power of yeast with different living cell ratios

由图4可知，死酵母的GIPE值接近0，证明酸化力法测定酵母活力的可行性。随着活细胞比例的增加，GIPE值增大，且线性关系良好，说明酸化力法能很好地反映不同活性酵母的酵母活力。

2.2.2 不同老化程度酵母的酸化力评价

酵母在无营养物质的环境下代谢减慢，细胞开始发生老化，活力降低，随着时间的延长，老化程度加深，细胞逐步死亡。酵母经离心收集、洗涤3次后重悬于无菌去离子水中，在30 ℃分别保温0，3，6，9，12，24 h，使酵母细胞发生不同程度的老化，分别测定不同老化程度酵母细胞的酸化力和亚甲基蓝染色率，见图5。

图5 不同老化程度的酵母酸化力及染色率Fig.5 The acidification power and dyeing rate of yeast with different aging degrees

由图5可知，随着酵母老化处理时间的延长，酵母的死亡率增加，GIPE值降低，可以看出GIPE 值与亚甲基蓝染色呈反相关。当进一步饥饿至发生死亡时(24 h)，GIPE 值降低至0，也就是说酵母完全失去活力。随着染色率的增加，由GIPE值指示的酵母活力降低，理论与实际相符，表明GIPE值可以较好地反映酵母活力。

2.2.3 酸化力法评价鲁氏酵母活力的稳定性

表1 酵母GIPE的稳定性Table 1 The stability of test of yeast's GIPE

由表1可知，酸化力法的稳定性实验结果中，GIPE值的相对标准偏差仅为3.39%(n=5)，小于5%，表明该方法评估酵母活力稳定、准确、可靠。

2.3 酸化力法评价酱油酵母活力的应用

2.3.1 酸化力法评价静置时间对酵母培养液质量的影响

在酱油酿造过程中，有时需要在酱醪中添加酵母菌液来提高酱油的发酵性能。然而在生产中，由于多种条件的限制会影响操作的及时性，酵母菌液在放置一段时间后会导致其活力的下降，从而影响预期的效果。可以通过酸化力法对不同放置时间的鲁氏酵母菌液进行活力评估，对菌液的效果进行预判。

图6 不同静置时间的鲁氏酵母的酸化力Fig.6 The acidification power of yeast with different static culture time

由图6可知，在培养基中酵母静置培养，2 h内酵母活力损失少，2 h后酵母活力有一定损失，5 h时酵母活力损失约15.2%。结果表明：鲁氏酵母在培养基中静置对其活力的影响较大，在生产应用中，可以通过酸化力法快速评估酵母菌液的活力，然后根据评估结果适当改变菌液的添加量，从而达到预期的发酵效果。

2.3.2 酸化力法对酱油发酵罐中酵母活力的评价

OD600和总酵母数等指标由于其检测的快捷，常被作为预判酵母质量的方法，然而这2项指标误差较大，无法准确评估酵母活力，即当酵母死亡后，这一类指标的检测结果仍会处于高值。而使用平板法计算活酵母数被看作是衡量酵母质量高低最准确的方法之一，然而该法却存在检验结果等待时间过长，人力资源成本花费较高的缺陷。下面使用酸化力法等4种方法对不同酱油发酵罐中的酵母活力进行评价，对比几种方法的评价效果。

图7 不同方法评价酱油发酵罐中的酵母活力Fig.7 Evaluation of the activity of yeast by different methods

注：1～3号培养罐使用营养强化配方，4～6号培养罐使用正常配方。

由图7可知，GIPE值的变化趋势与活酵母数的变化趋势最为接近，能较为准确地对酵母的质量进行评估。OD600能够反映不同培养罐间酵母增殖情况的差异，与活酵母数的变化趋势在一定程度上吻合，但契合程度低于GIPE值。此外，OD600、GIPE值与活酵母数的结果共同表明营养强化配方较正常配方酵母质量有所提升。

2.3.3 酸化力法测定酱油中酵母活力与酱醪发酵性能的对应性研究

酵母在发酵过程中会通过自身生长代谢活动产生一定量的酒精，通过检测发酵样品中的酒精含量变化，能够在一定程度上反映酵母的发酵性能。

图8 酵母活力与产酒精能力的关系Fig.8 The relationship between the activity of yeast and alcohol production capability

将活细胞和死细胞按不同比例混合接种到酱醪中进行发酵，在接种前检测其酸化力，考察其与产酒精能力的相关性。由图8可知，GIPE值与添加酵母后7天的酒精度变化趋势一致，相关性较好，这与酵母菌的生长特性有关，高活力的酵母发酵时生长速度较快，保证有较快的乙醇生成速度和生成量[15]。然而，随着发酵时间的延长，在14天时活细胞占比60%以上样品的酒精度均达2.8%以上。由此可知，酱醪发酵一段时间后，由于存在通氧、pH、温度等各种因素的影响，酵母活力低的菌液也可在酱醪中良好增殖，最终达到相似的酒精度，但添加酵母菌液初期的酒精含量变化与GIPE值具有一定的相关性，因此可以通过酵母添加液的GIPE值控制酵母初期的发酵情况。

3 结论

本文通过酸化力法评价从天然酱醪中筛选得到的鲁氏酵母活力，经测定条件优化可知，当鲁氏酵母泥浓度8%、葡萄糖添加量10%、检测温度30 ℃时评价效果最佳。同时，酸化力法能够准确地检测不同活性酵母以及不同老化程度酵母的酸化力，且检测结果相对标准偏差仅为3.39%，稳定性好。将酸化力法应用于酱油发酵过程中的相关指标评估发现，该方法能够有效评价酵母液静置过程中的活性变化、酱醪中的酵母活性，以及预判酵母液添加7天内的酒精度变化。应用酸化力法评价酱油中的酵母活力操作简单，结果准确，稳定性好，对酱油发酵过程中酵母活力的预判具有重要的指导意义，有一定的应用价值。