12种中药对20株广泛耐药铜绿假单胞菌的体外抑菌作用研究

黄晓辉 高贵阳 黄志昂

全世界范围内抗生素滥用情况十分严峻, 我国是抗生素使用率最高的国家［1］。细菌耐药是抗菌药物滥用的必然结果,近年来我国耐药菌甚至泛耐药菌感染越来越常见, 检出率不断上升［2］。铜绿假单胞菌是一种革兰阴性杆菌, 广泛存在于自然界和人体中, 是导致院内感染的重要病原菌之一, 中草药因为具有不良反应小、资源丰富、价格低、作用位点相对较多, 不易产生耐药等特点越来越受到药学和病原微生物研究者的关注［3,4］。本研究通过对鱼腥草等12种中药进行体外抑菌活性研究, 以筛选出来活性较好的中药, 为深入研究其活性化合物和作用机制打下物质基础, 为中药择优组方应用提供数字依据。

1 材料与方法

1. 1 材料 选取2017年4~11月本院呼吸内科、重症监护室、普外科患者的痰液、尿液、伤口分泌物分离所得广泛耐药铜绿假单胞菌(MDR-PA)20株(MDR菌株参照文献［5］的判断标准)(质控菌株为ATCC27853, 广东省临检中心)；中药：鱼腥草、五味子、黄连、黄芩、连翘、黄柏、金银花、虎仗、苦参、穿心莲、麻黄、夏枯草, 由榕城区中心医院中药房提供并鉴定, 参考穆廷杰等［6］的中药原液制备方法。仪器及设备：细菌鉴定及药敏分析仪TDR-1002及其配套试剂购于汕头康林医药有限公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 细菌鉴定与药敏试验 首先用TDR-1002对临床菌株进行鉴定和初步药敏试验, 并且用纸片扩散(K-B)法确认收集菌株对临床常用15种抗菌药物的敏感性, 药敏结果判断参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)2013年标准［7］, 质控菌株为ATCC27853。

1. 2. 2 12种中药的MIC测定 水煎液试管稀释法测定MIC,均按照CLSI2013版指南进行, 中药抗菌实验采用中药抗菌实验试管法, 参照文献［8］进行。

1. 2. 3 菌株编号 将从12种中药筛选出来的20株MDRPA分别以(S+数字)予以编号, 分别是S1, S2, S3.......S20。

1. 3 观察指标 肉眼观察测试管浊度, 每个测试管与对照管比较, 直至测试管与阴性对照管浊度相当, 则认为该管细菌未被抑制, 该测试管药物浓度代表该中药MIC。

2 结果

2. 1 药敏试验结果 20株MDR-PA对临床15种抗生素药敏试验检测结果, 见表1。

2. 2 MIC检测结果 鱼腥草, 黄连, 黄芩, 黄柏, 夏枯草对20株MDR-PA有不同程度的体外抑菌作用, 其他7种中药MDR-PA对体外无抑菌作用, MIC均值分别为38.71、54.72、39.10、38.90、47.70 mg/ml, 和标准菌株ATCC27853的MIC接近, 鱼腥草的体外抑菌作用最强。见表2。

表1 20株MDR-PA对抗生素的药敏情况［n(%)］

表2 12种中药对MDR-PA的MIC值检测结果(mg/ml)

3 讨论

随着抗生素药物的滥用, 目前抗生素治疗效果很差。从中药中发现新的有效化学成分已成为近年来国内外的研究热点。中药的确有抗菌、延缓、消除细菌耐药性的作用［9,10］。在医院内感染中, 革兰阴性菌的检出率明显高于革兰阳性菌,而且铜绿假单胞菌的检出率在革兰阴性菌中位于首位［11］,因此革兰阴性菌感染在临床上是急待解决的问题。近年来,PA广泛耐药性的产生给临床感染治疗带来严重挑战。武晓敏等［12］通过对临床分离的711株MDR-PA的耐药性分析和分布情况分析, 发现这711株菌株对头孢唑啉、复方新诺明、头孢呋辛酯、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、呋喃妥因、头孢呋辛耐药率达95.00%, 并且这711株菌株中, 89.59%来源于痰标本。由此可见呼吸道感染的高发病率, 因此研究中药及其活性成分对MDR-PA体外抑菌作用具有较大的临床意义。

清热解毒类中药(如黄连、黄芩、黄柏等)具有抗菌活性高、毒性低、不易产生耐药性等特点, 但目前中药对耐药菌发挥作用的机制尚不明确, 鱼腥草是三白草科植物, 主要抑菌成分是鱼腥草素, 其具有清热解毒、消痈排脓等作用［13-16］。鱼腥草素钠可通过抗生物被膜的活性从而起到抗菌的作用［14］, 也证实了作者的推测。夏枯草为唇形科植物,主要活性成分有萜类、甾体类、黄酮类、香豆素类等, 其味苦、性寒、辛, 具有清热解毒、清肝明目、抗炎解热、镇痛作用,水溶部分能抑制部分细菌生长［15-18］。

本次研究结果显示, 鱼腥草、黄连、黄芩、黄柏、夏枯草对20株MDR-PA有不同程度的体外抑菌作用, 其他7种中药MDR-PA对体外无抑菌作用, MIC均值分别为38.71、54.72、39.10、38.90、47.70 mg/ml, 和标准菌株ATCC27853的MIC接近, 鱼腥草的体外抑菌作用最强。表明了鱼腥草等5种常见的中药对MDR-PA均有体外抑菌作用, 其中鱼腥草对MDR-PA表现出较强的抑菌效果, 可在相对较低的水煎液浓度下抑制MDR-PA生长。抗生素药物敏感性试验绝大部分早已有国际通用的指南和标准, 但是细菌对中药的敏感性试验检测一直无明确国际标准, 《药典》中虽有关于中药K-B法检测方法, 不过其判断标准非常简单, 并且对所有中药及细菌都是一个耐药标准, 显然不符合药物和细菌特性［19-27］,更困难的是目前尚没有中药对PA的实际效果标准, 因此,本试验只是为中药在体外对MDR-PA证实存在抑制作用提供初步实验数据, 在人体内是否有效, 需要通过动物实验及人体试验等方法来确定, 不断创新与开拓, 才能使中药更好地造福于人类健康。