壳聚糖与丁香精油复合涂膜对调理猪排冷藏期间品质的影响

李鑫玲，张慧芸， 康怀彬*

1(河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳,471023) 2(食品加工与安全国家级实验教学示范中心，河南 洛阳,471023)

近年来，调理(ready-to-cook, RTC)肉制品因其方便和新鲜广受欢迎，但因其蛋白、脂肪含量丰富，在加工和销售过程中容易被氧化导致酸败、褪色，同时脂类和蛋白质发生降解、蛋白结构发生变化，从而影响肉品的营养价值和感官品质[1]。因此，如何提高调理肉制品的货架期成为调理肉制品保鲜领域的一个新的课题。

随着人们环保意识的增强，天然涂膜保鲜剂迅速成为保鲜领域研究的热点，并取得了一定的成果。壳聚糖是仅次于纤维素的第二大多糖，由于其生物相容性、抗菌活性和良好的成膜性等特性，被广泛用于肉类保鲜的研究[2-3]。MOHAN等[4]指出，与对照样品相比，壳聚糖涂膜可延长沙丁鱼保质期 3～5 d。然而，也有报道指出壳聚糖膜对肉品的抗氧化作用有限[5-6]，将其与天然抗菌剂结合使用是解决这一问题的有效方法。丁香精油是从丁香树的花蕾、叶子等提取的芳香精油，为美国食品和药物管理局普遍认可的食品添加剂；其主成分为丁香酚、β-丁香烯、乙酰丁香酚等[7]，具有良好的抗氧化和抗菌活性[8-9]。虽然丁香精油作为天然保鲜剂应用已被报道，但可食性涂膜保鲜液对调理猪排冷藏期间品质的影响研究甚少，考虑二者的协同作用，本研究采用壳聚糖及丁香精油对调理猪排进行涂膜保鲜，研究其对调理猪排4 ℃冷藏期间菌落总数、脂肪氧化、蛋白氧化及色差的影响，并采用拉曼光谱研究了调理猪排冷藏过程中蛋白结构的变化，为可食性涂膜保鲜剂开发及应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪背最长肌，购于当地超市；壳聚糖(脱乙酰度95%),上海蓝季生物试剂有限公司；丁香精油(丁香酚含量>90%)、丁基羟基茴香醚(BHA)，国药集团；三氯乙酸(分析纯)、硫代巴比妥酸、DNPH、乙酸乙酯、盐酸胍、DNTB，中国医药集团上海化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

H2050R台式高速大容量冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；UV-2800紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司； AD500S-H数显分散均质机，上海昂尼仪器仪表有限公司；CR400色差分析仪，日本KONICA MINOLTA公司；XPLORA ONE 785nm激光拉曼光谱仪，法国HORIBA公司。

1.3 方法

1.3.1 肉样的处理

超市采购豫南黑猪第12腰椎处背最长肌(屠宰后 2 h 内)，4 ℃条件下转移至实验室。经修整去除脂肪、筋、膜，切为50 mm×50 mm×10 mm(约50～80 g)的片，添加1.5%食盐、150 mg/kg焦磷酸钠、75mg/kg六偏磷酸钠和三聚磷酸钠、0.4%黑胡椒腌制24 h。壳聚糖保鲜液配制：用1 g/L的冰醋酸溶液将壳聚糖液解并定容，配制为2 g/L的壳聚糖溶液；精油添加量为猪排总质量的0.2%。

腌制过后分为对照组(未涂膜处理)、壳聚糖涂膜组(Ch)及壳聚糖+丁香精油涂膜组(Ch+Clo)，15份每组，分别将壳聚糖溶液和丁香精油均匀涂抹在剔除筋膜及表皮的猪排上，每个样本单独放置在一个密封的聚乙烯袋，在冰箱(4±1)℃保存13 d。根据预定的时间间隔，分别在1、4、7、10、13 d时随机抽取每个组的样本进行分析。

1.3.2 菌落总数的测定

依据 GB 4789.2—2016《食品卫生微生物学检测：菌落总数测定》。对照肉质量卫生指标菌落总数评价标准的一般建议标准执行：新鲜肉 1～104 CFU/g，次鲜肉 104～106 CFU/g，变质肉 106 CFU/g以上。

1.3.3 TBARS 值的测定

参考 FAUSTMAN等[10]的方法，稍加修改。精确称取0.3 g搅碎的调理猪排，加入0.3 mL BHA，然后加入3 mL TBA涡旋振荡，移取TCA-HCL溶液17 mL，沸水浴30 min(反应)，室温冷却，将10 mL上述溶液与10 mL氯仿混合，3 500 r/min条件下离心10 min。取上清液在532 nm处测定吸光值。TBARS值计算公式如下：

(1)

式中：A532 nm表示532 nm处样品的吸光度值；m表示样品质量，g。

1.3.4 羰基含量的测定

参考 BOTSOGLOU[11]的方法，略加改进。取3 g 肉样放入30 mL 20 mmol/L pH 6.5 PBS溶液中，5 000 r/min均质 20 s。分别取 4 份 0.6 mL均质液，加入3 mL 10% TCA，混匀，冰浴 15 min，11 000 r/min，离心 3 min，弃上清液。 再次加入 3 mL 10% TCA，重复上述步骤。上述样品中取 2 份加入1.5 mL 10 mmol/L DNPH 溶液，另外2份加入1.5 mL 2.0 mol/L HCl 做空白。在室温下静置1 h (每5 min涡旋振荡1次)，然后加入1.5 mL 20% TCA，冰浴15 min，11 000 r/min，离心3 min，弃上清。沉淀用乙酸乙酯-乙醇(体积比1∶1)洗涤3次，移取3 mL 6 mol/L盐酸胍溶液溶解蛋白沉淀(37 ℃)，然后冷冻离心10 min(9 500 r/min, 4 ℃ ) 去除不溶物，取上清液在370 nm下测吸光度。按公式(2)计算蛋白中羰基含量。

(2)

式中：A，吸光度；ε，摩尔吸光系数22 000，L/(mol·cm) ；Cpro，蛋白浓度，mg/mL。

1.3.5 总巯基测定

参考VOSSEN等[13]的方法，并略加改进。取1 g调理猪排肉糜，加入20 mL 0.05 mol /L PBS，均质20 s(5 000 r/min)。量取 1 mL 均质液加入9 mL 0.05 mol/L PBS混匀，14 000 r/min，4 ℃，离心15 min。然后取上清液3 mL，加入0. 04 mL 0.01 mol/L DTNB，混匀，40 ℃培养15 min。空白对照用0.05 mol/L PBS代替均质液，在412 nm处测定其吸光度。使用分子吸光系数13 600 L/(mol·cm) 计算蛋白中总巯基的含量。

(3)

式中：A，吸光度；V，样品体积；ε，摩尔吸光系数136 000，L/(mol·cm) ；I，光程1；m，肉样质量，g。

1.3.6 肉色测定

参照HAUTE等[13]的方法，并略作修改。采用CR-400型(Minolta-CR400)色差计(D 65光源，11 mm直径测量范围 10°视角)测定肉饼表面的颜色(亮度L*、红度a*、黄度b*)。

1.3.7 拉曼光谱测定

参照SHAO等[14]方法，稍作修改。用于拉曼光谱的测定：激光波长785 nm，功率100 mW，仪器用单晶珪进行频率校正，动波长扫描，扫描3次，积分时间60 s，检测范围400～3 600 cm-1，每个样品测试3次。用ALIX[15]的方法计算蛋白质不同二级结构(α-螺旋、β-折叠)含量。

1.4 数据统计分析

实验数据采用SPSS 19软件进行显著性分析(p<0.05)，用Origin 8.0绘图。

2 结果与分析

2.1 壳聚糖与丁香精油涂膜对调理猪排菌落总数的影响

如图1所示，在调理猪排冷藏期间，对照组和处理组菌落总数均呈现递增趋势，Ch+Clo处理组细菌总数显著低于(p<0.05)对照组和Ch处理组；第7天时，对照组细菌总数显著高于Ch处理组(p<0.05)，表明经壳聚糖涂膜处理后调理猪排微生物的生长受到显著抑制，壳聚糖对许多食品腐败菌和致病菌具有抗菌效果[16]。随着冷藏时间的延长，第7天对照组菌落总数达到5.70 lg CFU/g，第13天达到7.15 lg CFU/g；而第13天时Ch处理组和Ch+Clo处理组细菌总数分别比对照组低0.83和1.72个对数值。与对照组相比，Ch处理可延长微生物货架期3 d，Ch+Clo处理可延长6 d。许多研究表明丁香精油具有抗菌活性[17-18]，对病原菌和腐败微生物均有较好的抑制作用[19-20]。本研究表明，采用壳聚糖与丁香精油复合涂膜保鲜调理猪排，有效抑制了细菌生长，抗菌效果明显。

图1 壳聚糖与丁香精油涂膜对调理猪排冷藏期间菌落总数的影响Fig.1 Effects of chitosan and essential oils coating onthe standard plate count of RTC pork chops refrigeratedstorage

2.2 壳聚糖与丁香精油涂膜对调理猪排TBARS值的影响

壳聚糖与丁香精油涂膜对调理猪排冷藏期间TBARS值的影响见图2。

图2 壳聚糖与丁香精油涂膜对调理猪排冷藏期间TBARS值的影响Fig.2 Effects of chitosan and essential oils coating onthe TBARS of RTC pork chops during refrigerated storage

各处理组的TBARS值在第1天无显著差异(p>0.05)；所有组的TBARS值持续增加，13 d达到最高(p<0.05)。与对照组相比，Ch处理组的TBARS值显著下降(p<0.05)。第7天后，Ch+Clo处理组TBARS值显著低于对照组和Ch处理组(p<0.05)；在13 d冷藏期，Ch+Clo处理组的TBARS值最低，对脂质氧化抑制效果最好。这些结果表明，调理猪排采用Ch+Clo复合涂膜处理对延缓脂质氧化有积极作用。MOHAN等[4]报道，在4℃冷藏期间壳聚糖涂膜降低了沙丁鱼的TBARS值；此外，OSKOUEIAN等[21]报道，丁香精会阻碍罗非鱼过氧化值和TBARS值的增加。WAN等[22]将壳聚糖+姜精油处理与对照组和壳聚糖处理组的冷却猪肉相比，在不影响颜色和气味的情况下，二者能协同降低TBARS值和微生物数量。这些发现与本研究的结果一致，表明壳聚糖与丁香精油复合涂膜可以作为一种天然抗氧化剂来改善肉制品的贮藏稳定性。

2.3 壳聚糖与丁香精油涂膜对调理猪排羰基含量的影响

壳聚糖-丁香精油复合涂膜对调理猪排羰基含量的影响见图3。随着冷藏时间的延长， Ch+Clo处理组蛋白质羰基含量显著(p<0.05)低于对照组和Ch处理组；在第7天后， Ch处理组蛋白质羰基含量显著(p<0.05)低于对照组，表明壳聚糖涂膜具有抑制蛋白氧化的能力，这与壳聚糖可螯合从肌肉血红蛋白中释放出来的铁离子有关[23]。丁香精油对蛋白氧化抑制作用是由于其中的主要成分丁香酚类[24]，MAQSOOD等人[25-26]发现酚类化合物主要通过螯合金属离子、清除自由基、阻止脂质氧化，并与蛋白质结合形成共价化合物，从而阻止蛋白质羰基的形成，抑制蛋白质氧化。

图3 壳聚糖与丁香精油涂膜对调理猪排冷藏期间羰基含量的影响Fig.3 Effects of chitosan and essential oils coating on theprotein carbonyl compounds of RTC pork chops duringrefrigerated storage

2.4 壳聚糖与丁香精油涂膜对调理猪排巯基含量的影响

蛋白质氧化会造成巯基含量的减少，巯基容易被自由基攻击氧化形成二硫键，故巯基含量的变化是反应蛋白氧化程度的另一个重要指标[27]。如图4所示，随着冷藏时间的延长，对照组和处理组的蛋白质巯基含量均显著降低(p<0.05)；Ch处理组和Ch+Clo 处理组蛋白质巯基含量显著高于(p<0.05)对照组；Ch+Clo 处理组巯基含量显著高于Ch处理组。NIETO等[28]报道，将牛至油和迷迭香精油添加到生猪肉饼中，明显地延缓了巯基的损失；YU等[29]研究指出与壳聚糖涂膜相比，壳聚糖与丁香精油复合涂膜对草鱼片有更好的抗氧化效果，与本研究结果一致。

图4 壳聚糖与丁香精油涂膜对调理猪排冷藏期间巯基含量的影响Fig.4 Effects of chitosan and essential oils coating on theprotein sulphydryls compounds of RTC pork chops duringrefrigerated storage

2.5 壳聚糖与丁香精油涂膜对调理猪排肉色的影响

壳聚糖与丁香精油复合涂膜对调理猪排肉色的影响见表1。

表1 壳聚糖与丁香精油涂膜对调理猪排在贮藏过程中肉色的影响Table 1 Effects of chitosan and essential oils coating on thecolor characteristics of RTC pork chops during refrigeratedstorage

注：同一列肩标字母(a～e)不同，表示同一处理下，不同冷藏时间差异显著(p<0.05)；同一行肩标字母(A～C)不同，表示同一冷藏时间下，不同处理差异显著(p<0.05)。

如表1所示，在第1天时，对照组及处理组a*值无显著差异(p>0.05)。随着贮藏时间的延长，对照组的a*值显著降低(p<0.05)，与对照组相比，Ch处理组和Ch+Clo处理组显著抑制a*值(p<0.05)的降低，且在冷藏过程中保持稳定。由此可以看出，在4 ℃冷藏条件下，Ch处理组和Ch+Clo处理组对调理猪排有一定的护色作用，抑制了调理猪排颜色的劣变。KONG等[30]研究表明，与对照组相比，添加丁香提取物显著抑制了猪肉饼冷藏期间a*值的降低(p<0.05)。

随着贮藏期的延长，调理猪排的L*值和b*值均呈逐渐趋势，但同对照组相比，经Ch和Ch+Clo涂膜处理后，调理猪排的L*值和b*值的增加均不同程度地受到抑制。一些研究指出，肉制品中的脂肪氧化导致了肉颜色的劣变[31]；同时a*值的下降和b*值的升高与脂肪氧化是相关的[32]。FALOWO等[33]报道，天然植物提取物对肉制品的护色作用归因于酚类化合物的抗氧化能力。酚类化合物对肉制品脂质和蛋白质氧化的抑制作用已被广泛报道[34-35]，因此，壳聚糖-丁香精油复合涂膜对调理猪排护色作用可能是由于其中含有的丁香酚类化合物所致。

2.6 壳聚糖与丁香精油涂膜对调理猪排蛋白质结构的影响

本研究采用拉曼光谱检测蛋白结构的变化，拉曼光谱检测技术的优点是直接、无损，固体或液体食品可以根据其拉曼光谱的峰位、强度及位移的变化反应食品内部蛋白的结构变化[36]。

图5 调理猪排样本的拉曼光谱Fig.5 Raman spectrum of a RTC pork sample

图6 壳聚糖与丁香精油涂膜对调理猪排冷藏期间α-螺旋含量的影响Fig.6 Effects of chitosan and essential oils coating onthe protein α-helix compounds of RTC pork chops duringrefrigerated storage

图7 壳聚糖与丁香精油涂膜对调理猪排冷藏期间β-折叠含量的影响Fig.7 Effects of chitosan and essential oils coating onthe protein β-sheet compounds of RTC pork chops duringrefrigerated storage

由图6和图7可知，随着冷藏时间的延长，对照组调理猪排蛋白质 α-螺旋含量显著降低(p<0.05)，而β-折叠含量显著増加(p<0.05)，酰胺Ⅰ带向长波方向移动，表明在冷藏过程中，蛋白中的α-螺旋逐渐解折叠展开，转化为 β-折叠结构，多肽链在空间的走向发生重排；其中，Ch+Clo 处理组α-螺旋含量最高，而 β-折叠含量最低，与对照组和 Ch 处理组相比差异显著(p<0.05)，表明 Ch 膜和 Ch+Clo复合膜均可抑制调理猪排蛋白中的 α-螺旋向 β-折叠转化，且Ch+Clo处理组抑制效果明显；这进一步证实了蛋白氧化理化指标的测定结果，随着蛋白氧化，促进巯基向二硫键转化，疏水性增大，羰基值增加。BERHE等[42]对蛋白结构的研究发现，加热温度与蛋白氧化程度呈正相关越强，同时随着氧化的进行，酰胺Ⅰ带沿长波方向移动，与本研究结果一致。

3 结论

采用壳聚糖及壳聚糖与丁香精油复合涂膜作为涂膜保鲜剂对调理猪排进行保鲜，考察其对冷藏期间调理猪排品质的影响，并采用拉曼光谱研究了调理猪排冷藏期间蛋白结构的变化。通过研究表明，经壳聚糖涂膜处理的调理猪排在冷藏过程中菌落总数、脂质及蛋白氧化得到有效抑制，具有良好的保鲜效果；壳聚糖与丁香精油复合后显著提高了壳聚糖涂膜的抗菌和抗氧化作用，明显提高了调理猪排冷藏期间的品质和货架期，具备作为天然可食性涂抹保鲜剂应用于食品尤其是调理肉制品中的潜力。