齐整小核菌发酵产硬葡聚糖的补料控制策略

高荣伟，周景文，徐国强,2*

1 (江南大学，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122) 2 (江南大学，粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡，214122)

硬葡聚糖(scleroglucan)作为一种微生物多糖，以其良好的溶解性、假塑性、增稠性和稳定性广泛应用于食品工业[1]、石油工业[2]和化妆品工业[3]。目前硬葡聚糖的合成主要是通过微生物发酵的方式[4]，微生物发酵具有易控制、产品便于提取[5]和精制、生产效率高等优点[6]，但也存在底物利用率偏低、收率低和生产成本过高等问题[7]，制约了硬葡聚糖在更广泛行业的应用。由于硬葡聚糖和副产物草酸的具体合成途径尚不明确，很难通过基因改造等手段来增加多糖产量，降低副产物合成，所以目前更多的研究在降低发酵生产成本和不断改进硬葡聚糖生产工艺方面。KANG[8]等人通过改变通气提高硬葡聚糖产量，在发酵前96 h将通气量设定为0.75 vvm生产菌体，96 h后以0.4 vvm产多糖，发酵225 h硬葡聚糖产量达到最大值10.2 g/L，比0.4 vvm提高了30%。WANG[9]等人研究了发酵过程中的pH值调控策略，确定了发酵前96 h将pH值控制在3.5来增加生物量，96 h后将pH值控制在4.5来生产多糖的调控策略，发酵175 h硬葡聚糖达到15.0 g/L，比pH值控制在4.5提高了10%。WANG[10]等人研究了温度对硬葡聚糖生产的影响，确定了硬葡聚糖生产的最适温度为28 ℃，发酵196 h硬葡聚糖产量达到11.0 g/L，不过此温度下草酸产量较高，达到3.6 g/L。FARINA[11]等人探究了硝酸盐和铵盐作为硬葡聚糖生产氮源对菌体生长和多糖生产的影响，以150 g/L蔗糖和硝酸盐为碳氮源时，生物量和硬葡聚糖产量较高，硬葡聚糖产量达到26.0 g/L是以20 g/L蔗糖为碳源的4倍，底物利用率为17%。SURVASE[12]等人利用椰子水、甘蔗糖蜜和甘蔗汁等复合培养基进行深层发酵，其中甘蔗汁获得最高多糖产量23.87 g/L，椰子水和甘蔗糖蜜分别获得多糖12.58 g/L和18.45 g/L产量。目前关于硬葡聚糖的研究主要通过发酵原料(碳源、氮源、磷酸盐等)和发酵条件(通气、pH、溶氧、搅拌等)的改进来提高硬葡聚糖产量，获得了较好的结果，但是也存在一些问题，像生产成本高、底物利用率低等。

以小核菌株(SclerotiumrolfsiiWSH-G01)为研究菌株，在3 L发酵罐水平上确定了最佳搅拌转速的基础上，研究不同补料方式对多糖产量的影响，确定了最适的补料方式为恒速流加补料，在此条件下能够维持多糖生产所需要的较高的渗透压条件，获得较高生物量和硬葡聚糖产量，有效地提高了硬葡聚糖产量和生产强度，且底物利用率也进一步提高，降低了生产成本，为微生物发酵产硬葡聚糖的进一步放大培养提供了新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

菌株：本实验室保藏的小核菌株(SclerotiumrolfsiiWSH-G01)。

种子培养基[13](g/L)：葡萄糖30.0；KH2PO41.0；NaNO33.0；酵母浸粉1.0；KCl 0.5；MgSO40.25； pH 4.0。

发酵培养基(g/L):葡萄糖75.0；KH2PO41.0；NaNO33.0；酵母浸粉1.0；KCl 0.5；柠檬酸1.5；MgSO40.25 ； pH 4.0。

以上培养基115 ℃灭菌20 min。

1.2 实验仪器

3 L发酵罐，上海保兴生物有限公司；XWY-240恒温摇床，上海智诚仪器有限公司；台式高速离心机，德国eppendorf公司；高效液相色谱，美国Waters公司；恒温水浴锅，上海医疗器械研究所；高压灭菌锅，无锡医疗器械厂；葡萄糖/乳糖测定仪，深圳西尔曼科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 培养方法

摇瓶培养：将活化后的种子接种到装液量为100 mL的500 mL摇瓶中，28℃下220 r/min培养48 h。

发酵罐培养：以5%的接种量将培养好的种子液转接到3 L发酵罐中，装液量1.5 L，搅拌转速400 r/min，通气量1 vvm，30 ℃下培养[14]。

1.3.2 分析方法

残糖测定方法[15]：取发酵液1 mL，10 000 r/min离心5 min，取上清稀释一定倍数，用葡萄糖/乳糖测定仪测定葡萄糖剩余量。

发酵液蛋白去除[16]：蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性，将氯仿按多糖水溶液1/5体积加入，再加入氯仿体积1/5的正丁醇，剧烈振摇20 min，离心，分去水层和有机溶剂层交界处的变性蛋白，重复3次以上。

粗多糖的提取和生物量的测定参照文献[17]，草酸检测条件参照文献[18]。

数据统计：生物量、残糖和多糖产量的实验数据每隔8 h取发酵罐发酵液进行测定，用Excel软件计算3次平行实验结果得到平均值和方差；pH值利用pH电极实时检测，每8 h记录1次。

2 结果与分析

2.1 3 L发酵罐条件下最佳搅拌转速的确定

发酵过程中的溶氧情况是影响菌体生长与产物合成的重要因素，而改变溶氧状态的一个重要方式就是改变搅拌速度，搅拌转速的改变可以使罐体维持真菌产糖所需的溶氧量且适宜的搅拌转速可以缩短发酵周期，但是高搅拌转速产生的高剪切力也会影响菌体的生长。在生产硬葡聚糖的研究中发现氧限制会降低副产物草酸的产量，因为草酸合成酶在厌氧条件下被抑制，所以较低的氧气供应有利于多糖的生产[19]。在前期分批发酵确定了最适葡萄糖浓度为75 g/L，最适通气量为1 vvm的基础上进行了搅拌速度优化，在3 L罐上采用不同搅拌速度(200、400、600 r/min)研究其对小核菌合成硬葡聚糖的影响。

发酵结果如图1所示，在不同转速下，菌体生长和硬葡聚糖合成表现出明显的差异。

A-200 r/min; B-400 r/min; C-600 r/minΔ-pH;▶-草酸; ○-残糖; ■-硬葡聚糖; ●-干重图1 搅拌转速对发酵的影响Fig.1 The effect of stirring speed on fermentation

较低转速更利于多糖的合成和菌体生长，而且副产物草酸的合成受到抑制。当搅拌转速为600 r/min时，葡萄糖消耗、菌体生长和多糖合成明显受到抑制。在转速为600 r/min时发酵56 h硬葡聚糖达到最高值15.24 g/L，葡萄糖消耗量为38 g/L，细胞干重为9.96 g/L，由于高转速引起的高剪切力抑制菌体的生长，导致多糖产量不高。搅拌转速为200 r/min时，发酵64 h多糖产量达到最大值16.24 g/L，细胞干重为11.62 g/L，葡萄糖消耗量为40 g/L，过低的转速导致发酵过程中氧气不足，从而降低了产物合成速率，生产周期增加；相比之下，400 r/min时，葡萄糖消耗、菌体生长和多糖合成效果相对较好。发酵56 h葡萄糖消耗量为45 g/L，细胞干重为11.64 g/L，多糖产量为18.48 g/L，较200 r/min和600 r/min分别提高了14%和21%。生产强度为0.33 g/(L·h)，较200 r/min[0.25 g/(L·h)]和600 r/min[0.27 g/(L·h)]分别提高了32%和22%。底物利用率为24.6%，较200 r/min和600 r/min硬葡聚糖产量分别提高了13%和21%。搅拌速度越小罐体溶氧越低副产物草酸产量越小，200 r/min草酸最高产量为1.96 g/L，400 r/min草酸最高产量2.3 g/L，600 r/min草酸最高产量为3.6 g/L。前期研究中发现高硬葡聚糖水平存在于细胞合成替代能源的过程，硬葡聚糖合成的调控是在缺氧或压力下激发的[21]，所以硬葡聚糖的合成不需要高溶氧条件并且副产物草酸在低氧条件下的合成受到抑制。但是过低的搅拌转速条件下细胞溶氧严重不足，影响菌体生长。因此确定分批发酵的搅拌转速为400 r/min。

2.2 一次性补料对发酵的影响

2.2.1 一次性补料时间对发酵的影响

前期研究发现真菌多糖的最高产量不是在对数后期就是在稳定增长阶段[20]，所以补料时间的确定非常重要。从3 L发酵罐上硬葡聚糖分批发酵结果来看，发酵0～32 h是生长适应期，菌体干重增加缓慢，葡萄糖消耗量较小；发酵32～56 h是生长对数期，菌体干重增加较快，葡萄糖消耗较大；发酵56 h以后为生长稳定期，菌体干重增加变缓，葡萄糖消耗量较小。在发酵过程中32～56 h葡萄糖消耗速率最快，发酵至56 h消耗大约40 g/L，后期葡萄糖消耗减少，多糖由于β-1,3葡聚糖酶的作用下分解导致产量降低。为探究葡萄糖补料对多糖产量的影响，在初始葡萄糖浓度为75 g/L，通气量为1 vvm，搅拌转速为400 r/min条件下分别选择发酵32、40、48 h时进行补料，一次性补入葡萄糖30 g/L。

结果如图2 所示，随着补料时间的推后，底物消耗、菌体生长和产物合成存在较大的差异。

A-32 h; B-40 h;C-48 hΔ-pH;▶-草酸; ○-残糖; ■-硬葡聚糖; ●-干重图2 一次性补料中葡萄糖添加时间对发酵的影响Fig.2 The effect of glucose addition time on fermentation inOne-time Feeding

总体来看，硬葡聚糖产量呈现先上升后下降的趋势，这是由于后期多糖水解酶的水解作用，将硬葡聚糖分解为小分子多糖[21]；细胞干重呈现一直增长的趋势，先快速增长后缓慢增长。补料时间过早培养基中碳源浓度较高，利于草酸代谢途径合成草酸[22]，草酸产量大幅度增加，严重影响了硬葡聚糖的合成。补料时间为32 h，发酵72 h硬葡聚糖达到最高产量23.02 g/L，葡萄糖消耗量为62 g/L，细胞干重为16.36 g/L，草酸产量达到3.38 g/L。过晚的加入葡萄糖错过多糖合成的最佳时期，多糖产量较低且发酵周期延长，底物利用率降低。补料时间为48 h时，发酵80 h硬葡聚糖产量达到24.87 g/L，葡萄糖消耗量为65 g/L，细胞干重为17.0 g/L，草酸产量为2.8 g/L。相比较而言，在40 h一次性补料达到了较好的发酵效果，发酵72 h时硬葡聚糖产量达到最大值25.66 g/L，比32 h和48 h一次性补料分别提高了11%和9%；生物量达到19.32 g/L，比32 h和48 h一次性补料分别提高了18%和20%；生产强度为0.35 g/L/h，比32 h和48 h一次性补料分别提高了9%和6%，草酸产量为2.3 g/L均低于其他2种条件。前期分批实验结果表明硬葡聚糖的大量合成在细胞生长对数后期约为40～56 h，过早的加入葡萄糖促进了草酸代谢途径合成，不利于多糖的合成；在对数生长后期加入葡萄糖，错过了菌体生长和产物合成的最佳时期，也不适合多糖的生产。因此确定一次性补料时间为40 h。

2.2.2 不同葡萄糖添加量对发酵的影响

硬葡聚糖的合成受环境渗透压的影响，葡萄糖的添加能提高发酵环境渗透压从而提高硬葡聚糖的产量，添加适量葡萄糖来控制合适的渗透压环境对硬葡聚糖的生产具有重要的意义。依据上述实验结果发酵40 h进行补料，探究一次性补料葡萄糖添加量对发酵的影响，分别向发酵罐中一次性补入20、30、40 g/L葡萄糖。

结果如图3所示，多糖产量和菌体生长随葡萄糖添加量的增加而增加，葡萄糖的大量添加为菌体营造了高压环境，促使菌体为自我保护而消耗葡萄糖来合成多糖[22]。

A-20 g/L;B-30 g/L;C-40 g/LΔ-pH;▶-草酸; ○-残糖; ■-硬葡聚糖; ●-干重图3 不同葡萄糖添加量对发酵的影响Fig.3 The effect of different glucose additions on fermentation

添加20 g/L时，发酵72 h硬葡聚糖产量达到23.87 g/L，葡萄糖消耗量为50 g/L，细胞干重为15.25 g/L，底物利用率25%；30 g/L时，72 h硬葡聚糖产量达到25.31 g/L，葡萄糖消耗量为52 g/L，细胞干重17.36 g/L，底物利用率24%；40 g/L发酵72 h硬葡聚糖产量达到26.31 g/L，葡萄糖消耗量为50 g/L，细胞干重18.52 g/L，底物利用率23%。40 g/L时多糖产量较20 g/L和30 g/L分别提高了6%和4%；生物量达到18.52 g/L，较20 g/L和30 g/L分别提高了21%和7%；生产强度为0.37，较20 g/L和30 g/L分别提高了12%和6%。30 g/L时草酸产量是最高的，达到2.14 g/L比20 g/L和40 g/L分别提高了19%和42%，说明草酸的产量随葡萄糖的增加而增加当葡萄糖增大的一定浓度时草酸的产生反而被抑制，可以采用改变渗透压降低副产物生成。底物利用率随葡萄糖的添加而降低，40 g/L时最低。3种条件下底物消耗量相差不大，推测在高渗透压环境下，硬葡聚糖合成效率更高。前期研究在以50或75 g/L蔗糖为碳源的培养基中添加NaCl或KCl来模拟150 g/L蔗糖为碳源的渗透压条件，比仅以75 g/L蔗糖为碳源多糖产量提高了约50%[23]。因此后期研究中可以通过添加NaCl等来提高环境渗透压从而降低生产成本。30 g/L产量并没有40 g/L高，但是底物利用率偏高一些，生产成本也相对较低。因此添加量选择30 g/L。从以上结果可知通过葡萄糖的添加，培养环境达到较高的渗透压水平，多糖产量和细胞干重有所提升。但是大量葡萄糖的添加没有被菌体很好地利用，底物利用率较低，需要探索其他的补料方式来以比较温和的葡萄糖添加方式提高多糖产量。

2.3 恒速流加补料对发酵的影响

一次性补料优化对硬葡聚糖生产确实有效果，但是葡萄糖的大量添加使得菌体置于高浓度的葡萄糖中，需要一段时间的适应，硬葡聚糖产量并没有很大的提升，反而底物利用率降低。为克服葡萄糖的大量添加造成的葡萄糖浓度过高对菌体生长的影响，采用恒速流加补料的方式来控制葡萄糖的添加量，以达到提高硬葡聚糖产量的效果。根据上述实验结果确定了葡萄糖的补料开始时间为发酵40 h，持续补料时间32 h。以葡萄糖总浓度为(200、300、400 g/L)流加速度分别为[12、9、6 g/(L·h)]来研究恒速流加补料对多糖产量的影响。

结果如图5所示，采用恒速流加方式细胞没有出现不适应的现象，葡萄糖消耗和菌体生长迅速，在32 h硬葡聚糖就进入快速合成阶段。葡萄糖总浓度越大，菌体生长、产物合成和葡萄糖消耗效果越好。葡萄糖总浓度为400 g/L时，发酵72 h时硬葡聚糖产量达到最大值32.62 g/L，较200 g/L和300 g/L分别提高了8%和5%；生物量达到22.36 g/L，较200 g/L和300 g/L分别提高了17%和4%；生产强度达到0.45 g/(L·h)，较200 g/L和300 g/L分别提高了7%和5%；底物利用率为28%，相比较于以150 g/L蔗糖生产硬葡聚糖的底物利用率17%[11]，提高了65%；副产物草酸随葡萄糖总浓度的增加而增加，研究表明草酸形成的有利条件为较高的碳水化合物浓度和充足的氧气的条件下[24]，而且副产物草酸和细胞干重呈正相关，都呈持续增长状态[21]。实验结果表明恒速流加补料能克服葡萄糖的大量添加对菌体生长的影响，葡萄糖消耗量大幅度增加，生物量提高明显，硬葡聚糖产量有很大的提升。恒速流加补料在一定程度上提高了硬葡聚糖生产所需要的高渗透压环境，刺激了多糖合成。

A-200 g/L;B-300 g/L;C-400 g/LΔ-pH;▶-草酸; ○-残糖; ■-硬葡聚糖; ●-干重图4 不同恒速流加补料速度对发酵的影响Fig.4 Effects of different constant speed and feeding rateson fermentation

3 结论

为了提高齐整小核菌(SclerotiumrolfsiiWSH-G01)利用葡萄糖高效生产硬葡聚糖，在确定了最佳搅拌转速的基础上，研究了2种不同补料控制策略对硬葡聚糖产量的影响，确定了搅拌转速400 r/min，发酵40 h开始补料，以葡萄糖总浓度为400 g/L，流加速度6 g/(L·h)持续补料32 h的补料策略，获得硬葡聚糖产量32.62 g/L，比一次性补料提高了15%；生产强度0.45 g/(L·h)，提高了16%；底物利用率28.4%，高于一次性补料策略，较分批发酵提高了15.5%。硬葡聚糖的生产适宜在较低溶氧的环境条件下，因此采用较低搅拌转速来维持环境中氧气浓度。高渗透压能刺激多糖合成并且抑制草酸代谢，相比较于一次性补料恒速流加补料产糖效果更好。既能维持较高浓度的渗透压来促使菌体消耗葡萄糖产多糖，又能克服葡萄糖的一次性大量添加对菌体生长的抑制作用，底物利用率也有所提高达到28%，达到较好的发酵效果。但硬葡聚糖生产过程中还存在后期生成的β-1,3葡聚糖酶水解硬葡聚糖降低产量和底物利用率降低等问题，在以后的研究中将主要以这两个方向为重点方向。