亚硒酸钠对短乳杆菌CGMCC 6683细胞膜的影响

林官根，张紫薇，党芳芳，满朝新，姜毓君

(东北农业大学 食品学院，乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨，150030)

利用微生物将无机硒转化为单质硒的研究已开展多年[1-4]，单质硒与无机硒相比较而言，具有低毒性以及高生物利用率等优点[5-6]，且这种生产单质硒的方式更加方便、高效和经济，具有十分广阔的应用前景。但是在微生物转化无机硒为单质硒的过程中，菌体生长会受到抑制，这已成为生产诸如富硒酸奶等富硒发酵食品的瓶颈[7-8]。本研究通过表观观察以及基因水平的检测，研究短乳杆菌(Lactobacillsbrevis)CGMCC 6683在代谢无机硒过程中的理化指标响应情况，并探讨了该响应与菌体生物量下降之间的关系，发现菌体抵抗无机盐胁迫时的关键基因。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

短乳杆菌(L.brevis)CGMCC 6683，由中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏。

1.1.2 培养基

MRS液体培养基，MRS固体培养基，青岛高科园海博生物技术有限公司。

1.1.3 实验试剂

Na2SeO3(分析纯)，天津化学试剂研究所；细菌总RNA提取试剂盒(货号：DP430)，反转录试剂盒(货号：RR037A)，荧光定量PCR试剂盒(货号：RR820A)，天津生化科技(北京)有限公司； LIVE/DEAD®BacLightTM细菌细胞活性测定试剂盒，西格玛公司；丙二醛检测试剂盒，碧云天试剂盒(货号：S0131)。

1.1.4 基因选取与引物设计

选取6个与细菌抗氧化应激相关的基因用于后续实时荧光定量PCR研究，同时采用16S rRNA作为内参基因。所有引物由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成，基因与引物信息见表1。

表1 引物信息Table 1 The information of the primers

1.2 仪器与设备

SU-8010场发射扫描电子显微镜，日本日立公司；TCS SP2 AOBS，德国Leica公司；MX3000P实时荧光定量PCR仪，美国安捷伦公司。

1.3 实验方法

1.3.1 生物量测定

将活化好的短乳杆菌以5%的接种量接种到25 mL含有不同浓度Na2SeO3(0、2、5、10、15、20 mmol/L)的MRS液体培养基中，37 ℃、150 r/min恒温摇床培养24 h，取培养好的菌液1 mL，梯度稀释后进行平板涂布(GB 4789.35—2016)[9]，待生长36～48 h后进行平板计数，以Na2SeO3浓度(mmol/L)为横坐标，细菌生物量的对数值(lg CFU/mL)为纵坐标，绘制短乳杆菌的生物量柱状图。

1.3.2 场发射扫描电镜观察菌体

取用在含有不同浓度Na2SeO3(0、2、5、10、15、20 mmol/L)的MRS液体培养基中培养24 h后的短乳杆菌1 mL，加入体积分数为2.5%的戊二醛，并置于冰箱中(4 ℃)1.5 h以上，进行固定。然后对样品进行冲洗、脱水和置换，置于冷冻干燥仪干燥4 h。将得到的样品粘在扫描电镜样品台上进行镀膜，最后使用扫描电镜观察并拍摄电镜照片，并对菌体表面元素进行元素分析。

1.3.3 细菌细胞活性测定

将培养好的短乳杆菌在8 000 r/min 下离心10 min，将菌泥重悬于2 mL生理盐水中。将各6 μL的SYTO 9和PI染料加入到2 mL的离心管中得到混合染料工作液。各取100 μL菌悬液与工作液充分混合，在室温下孵育15 min。用激光共聚焦显微镜对孵育好的样品进行观察，设置参数为激发波长485 nm，SYTO 9和PI的发射波长各自为542 nm和610 nm。

1.3.4 实时荧光定量PCR检测

分别吸取在含有0和5 mmol/L Na2SeO3的MRS培养基中生长24 h后的短乳杆菌菌液各1 mL。离心得到菌泥后按照试剂盒说明书提取短乳杆菌总RNA，然后进行RNA琼脂糖凝胶电泳检测菌体RNA的质量。合格后进行反转录得到菌体cDNA，调整浓度后进行实时荧光定量PCR检测。

1.3.5 菌体内丙二醛变化测定

吸取在含有0和5 mmol/L Na2SeO3的MRS培养基中生长24 h后的短乳杆菌菌液各1 mL，在6 000 r/min下离心10 min收集菌泥，向得到的菌泥中加入1 mL细菌裂解液并在涡旋仪上充分混合裂解。分别取100 μL对照组和实验组裂解后样品于PCR管中，再分别向其中加入200 μL丙二醛检测工作液，混匀后置于PCR仪中在100 ℃下加热15 min。水浴冷却至室温，在1 000 r/min下离心10 min，取200 μL样品于96孔酶标板中，调节酶标仪的激发波长为535 nm，发射波长为553 nm，进行荧光检测，最终结果以实验组相对对照组的荧光变化倍数表示。

1.3.6 数据处理与分析

以上实验每组设置3个平行，结果值以平均值±标准差的形式表示，显著性分析以p≤0.05为标准进行统计分析。所有数据和图表均相应用SPSS 软件(19.0版)和Origin软件(8.0版)进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 短乳杆菌生物量

据图1可知，短乳杆菌在含有不同浓度Na2SeO3(0、2、5、10、15、20 mmol/L)的培养基中生长24 h后，其生物量发生锐减，数量级由108CFU/mL下降至104CFU/mL，说明随着培养基中Na2SeO3浓度的升高，菌体生长受到该无机盐的抑制也随之增强。

图1 短乳杆菌在含有不同浓度Na2SeO3培养基中生长24 h后的生物量Fig.1 The biomass of L.brevis growing in the mediacontaining different concentrations of Na2SeO3

2.2 场发射扫描电镜图像

将对照组与处理组的短乳杆菌置于扫描电子显微镜下进行观察，根据图2可知未经Na2SeO3处理的菌株菌体表面光滑平整，而经处理的菌株菌体表面出现圆形颗粒状物质，初步推断该颗粒为经短乳杆菌还原得到的单质硒。此外，处理组菌体表面同时伴有皱缩、塌陷甚至破裂的现象出现，而且这种现象会随Na2SeO3浓度的增加而更加明显。将场发射扫面电子显微镜与X-射线能谱仪联用，分析处理组菌体表面颗粒物质的组成元素，在能谱图上(图3)1.5 keV处有吸收峰出现，该峰代表元素硒的存在[10]，而在对照组中未在此处出现吸收峰，因此可以判定上述圆形颗粒状物质为单质硒。

A-对照组；B-2 mmol/L Na2SeO3；C-5 mmol/L Na2SeO3；D-10 mmol/LNa2SeO3；E-15 mmol/L Na2SeO3；F-20 mmol/L Na2SeO3图2 短乳杆菌在未经Na2SeO3处理以及经不同浓度Na2SeO3处理后的场发射扫描电子显微镜图像Fig.2 Scanning electron micrograghs images of L.brevisuntreated and treated with Na2SeO3

A-对照组；B-实验组(5 mmol/L Na2SeO3添加量)图3 X射线能谱分析仪分析短乳杆菌表面元素Fig.3 X-ray energy spectrometry analysis of L.brevis

2.3 细菌细胞完整性

检验细菌细胞在未经Na2SeO3处理以及经不同浓度Na2SeO3处理后菌体完整性。实验用荧光染料SYTO 9是一种核酸结合染料，它可以标记所有待检测菌体，荧光呈绿色；PI只可以标记细胞膜发生损伤的细胞，并且由于其与核酸亲和能力强于SYTO 9，所以可以将SYTO 9替换掉，荧光呈红色和(或)橘黄色[11]。由图4可知，短乳杆菌未经Na2SeO3处理，24 h后，激光共聚焦显微镜下的荧光呈绿色，表明菌体表面完整未发生损伤；而经不同浓度Na2SeO3处理后的短乳杆菌，其镜下荧光呈红色和(或)橘黄色，并且这种现象随着Na2SeO3浓度的增加而更加明显，说明菌体细胞膜受到损伤。在20 mmol/L Na2SeO3实验组中(图4-F)，激光共聚焦显微镜下的可观测菌体数量明显少于其他组别，该现象与2.1部分生物量测定结果相一致，但是荧光呈现红色的菌体数目几乎为100%，进一步说明向培养基中添加高浓度Na2SeO3会使菌体细胞膜受损，从而导致生物量下降。

A-对照组；B-2 mmol/L Na2SeO3；C-5 mmol/L Na2SeO3；D-10 mmol/LNa2SeO3；E-15 mmol/L Na2SeO3；F-20 mmol/L Na2SeO3图4 短乳杆菌在未经Na2SeO3处理以及经不同浓度Na2SeO3处理后的激光共聚焦图像Fig.4 Laser scanning confocal microscope images of L.brevis untreated and treated with Na2SeO3

2.4 RNA琼脂糖凝胶电泳图

为检验所提菌株RNA的质量是否可以用于后续实时荧光定量PCR，利用琼脂糖凝胶电泳方法对所提RNA进行电泳(图5)，存在23S、16S和5S三条条带，条带清晰完整无杂带，说明提取的RNA无明显降解及污染，可用于后续实验。

M-marker;1-对照组；2-实验组图5 试验样品琼脂糖凝胶电泳图Fig.5 Agarose gel electrophoresis of experimental samples

2.5 实时荧光定量PCR检测结果

本研究选取了6个与细菌抗氧化应激相关的基因，以此检测短乳杆菌在含有Na2SeO3的培养基中生长过程中体内氧化应激状态。根据图6可知，有2个基因在处理组中发生显著上调(p≤0.05)，分别是编码甲硫氨酸(R型)亚砜还原酶的基因LVIS_0809(上调4.96倍)以及编码硫氧还蛋白还原酶的基因LVIS_0645(上调3.25倍)。其余4个基因的表达量没有发生显著变化(p>0.05)，分别是2个编码甲硫氨酸(S型)亚砜还原酶的基因LVIS_0810(上调1.62倍)和LVIS_0737(上调1.86倍)，编码谷胱甘肽过氧化物酶的基因LVIS_2003(上调1.17倍)以及编码过氧化氢酶的基因LVIS_0906(不变)。据FAHEY研究[12]，谷胱甘肽在革兰氏阳性菌中的含量很少，所以编码谷胱甘肽过氧化物酶的基因没有发生显著性变化，而甲硫氨酸亚砜还原酶以及硫氧还蛋白还原酶已被证实是生物体内抗氧化的主要物质[13]，因此编码该2种蛋白的基因发生显著上调，说明短乳杆菌经Na2SeO3处理后体内出现氧化应激状态，出现的反应活性氧会致使膜发生脂质过氧化，从而导致菌体受损。

图6 实时荧光定量PCR结果图Fig.6 qRT-PCR resulted image注：*代表显著差异(p≤0.05)

2.6 丙二醛变化测定结果

本实验采用的试剂盒主要检测原理：硫代巴比妥酸与丙二醛反应产生一种红色物质，该产物在535 nm可以被激发产生553 nm最大发生波长，因此可以进行荧光检测。由图7可知，短乳杆菌在含有5 mmol/L Na2SeO3的培养基中生长，体内丙二醛含量较对照组有显著性提高(p≤0.05)，其相对荧光值是对照组的2.47倍。说明短乳杆菌在降解Na2SeO3为单质硒的过程中，会发生氧化应激，产生的反应活性氧与膜上脂肪酸发生脂质过氧化反应，进而使菌体细胞膜受损，该结果与2.5部分的实时荧光定量PCR检测结果互为印证。

图7 丙二醛含量相对荧光变化图Fig.6 The figure of relative fluorescence change of MDA注：*代表显著差异(p≤0.05)

3 讨论

短乳杆菌在含有无机盐Na2SeO3的培养中生长24 h后，菌体表面附着一种呈光滑椭圆形状的颗粒，其主要元素为硒元素，因此可知短乳杆菌可以将Na2SeO3转化为零价态的单质硒。然而菌体在还原Na2SeO3为单质硒的过程中，其生长会受到抑制，生物量显著下降。通过场发射电子扫描显微镜观察，短乳杆菌在不添加Na2SeO3的培养基中生长时，菌体表面光滑完整，在含有Na2SeO3的培养基中生长时，会有表面皱缩、塌陷甚至破裂的菌体出现，这种现象会随着所添加Na2SeO3浓度的增加而更加明显。为进一步验证其余表面没有明显破损的菌体是否完全没有受到Na2SeO3添加的影响，本研究进一步利用2种核酸结合荧光染料进行检测，通过激光共聚焦显微镜观察，发现对照组中的菌体呈现绿色荧光，而在添加Na2SeO3的处理组中大部分菌体呈现橘黄色或者红色荧光，说明Na2SeO3会使菌体膜发生破损。为探究造成这种膜损伤的原因，利用实时荧光定量PCR技术检测了6个与细菌抗氧化应激相关的基因表达量情况，通过结果发现，在处理组中短乳杆菌体内编码甲硫氨酸(R型)亚砜还原酶的基因以及编码硫氧还蛋白还原酶的基因发生了显著上调，说明Na2SeO3可以诱导菌体氧化应激的发生，在这一过程中产生的活性氧会攻击菌体膜，使其发生脂质过氧化而造成菌体表面受损，从而进一步引起菌体死亡生物量下降，后续的丙二醛含量变化情况检测结果也表明短乳杆菌在含有5 mmol/L Na2SeO3的培养基中生长后，其体内丙二醛的含量上升，与实时荧光定量PCR的结果互为印证，进一步说明菌体内脂质过氧化反应的发生。除此之外，单质硒的转运以及渗透压的变化而使菌体出现膜损伤的原因也不能完全排除。综上所述，短乳杆菌CGMCC 6683在降解无机盐Na2SeO3为单质硒的过程中，由于体内氧化应激产生的活性氧会使菌体膜受损，从而导致了菌体生物量的下降。今后应在膜保护剂方面做出进一步的研究，为工业化生产富硒食品提供可行性保障。

4 结论

短乳杆菌在不添加以及添加2 mmol/L Na2SeO3MRS培养基中生长24 h后菌体生长正常，而在添加5 mmol/L以及更高浓度Na2SeO3的培养基中生长，则会出现毒性效应。细胞膜的完整性和细胞表面形态都随着Na2SeO3浓度的增加而朝着菌体膜受损的方向发展。同时在Na2SeO3的诱导下，菌体内部分与氧化应激相关的基因发生上调，丙二醛含量的增加与实时荧光定量PCR结果相互验证，表明菌体细胞膜发生脂质过氧化反应。以上结果表明，短乳杆菌在降解Na2SeO3为纳米硒的过程中，由于细胞膜受损导致其正常生理状况会发生改变，同时伴随着生物量的下降。