c-FOXP3对肾透明细胞癌体外侵袭迁移的效应及机制研究

种 岳，朱国栋，张海宝，徐 珊，王新阳，贺大林

(西安交通大学第一附属医院泌尿外科，陕西西安 710061)

1 材料与方法

1.1实验材料786-O和ACHN细胞系，均购于美国ATCC细胞库；Millicell小室(Millipore，USA)；细胞培养皿(Corning，USA)；Matrigel(BD,USA)；RPMI-1640培养基(Gibco，USA)；胎牛血清(杭州四季青公司，China)；0.25%胰酶(Sigma，USA)；一抗：anti-FOXP3(Abcam,ab20034)，二抗：山羊抗鼠(北京中杉金桥，ZB-2305),羊抗兔(北京中杉金桥，ZB-2301)；ECL发光液(Bio-rad，USA)。从TCGA(The Cancer Genomic Atlas)数据库中的Human Protein Atlas子数据库下载分析528例肾癌患者的生存预后数据。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养 使用含有10%胎牛血清的1 640培养基培养细胞，均置于37 ℃，5% CO2条件的培养箱中培养。

1.2.2细胞感染 于苏州吉玛基因公司订购c-FOXP3敲低慢病毒(含3个敲低序列和1个阴性对照)，分别将786-O和ACHN接种于24孔板内，每孔4×104个细胞，完全培养基37℃、5% CO2过夜。用含2%胎牛血清的靶细胞维持液更换完全培养基并分别加入病毒10 μL，培养过夜后更换为完全培养基继续培养，待细胞需要传代时传至6 cm培养皿并加入嘌呤霉素筛选(786-O 1 μg/μL；ACHN 6 μg/μL)，利用Western blot鉴定敲低效率。

1.2.3Western blot 收集细胞团块并用PBS清洗细胞团块3次，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，冰浴10 min，于预冷的4度离心机15 000 r/min离心15 min后收集上清，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度后加入6×上样缓冲液并于沸水中煮5 min。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同分子质量大小蛋白分离，将凝胶上蛋白连同marker转移至PVDF膜，5%牛奶封闭1 h，分别加入相应的一抗(c-FOXP3 1∶1 000;β-actin 1∶1 000; N-cadherin 1∶1 000; E-cadherin 1∶1 000; Vimentin 1∶1 000)，4 ℃摇床过夜。TBST缓冲液洗膜三次，每次10 min，孵育相应二抗(山羊抗兔、山羊抗鼠均为1∶3 000稀释)1 h，TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min。加入显影液显影。

1.2.4划痕实验 用marker笔在6孔板背后，用直尺均匀划横线，大约每隔0.5～1 cm一道，横穿过孔，每孔至少穿过3条线。在每孔中接种约5×105个细胞(786-O和ACHN)，将培养板置于 37 ℃，5% CO2培养箱内过夜，第2天用微量上样器吸头垂至于背后的横线划痕，用PBS缓冲液洗细胞3次并加入无血清培养基，继续放入37 ℃、5% CO2培养箱培养分别并于0、24、36、48 h取样，拍照。

1.2.5Transwell细胞迁移实验及侵袭实验 分别向Millicell小室的上室加入 200 mL 786-O和ACHN细胞悬液，含4×104个细胞。向小室的下室加入含10%胎牛血清培养基800 μL，将培养板置于 37 ℃，5% CO2培养箱内培养24 h。取出小室，用棉签擦去上室的细胞。PBS缓冲液洗小室3次后，将下室细胞置于4%多聚甲醛溶液中固定 10 min。再用 PBS缓冲液洗小室3次，随后将下室置于0.1%结晶紫染液染色10 min。PBS缓冲液洗去残留结晶紫染料后置于显微镜下观察。取 5个100×随机视野计数穿膜细胞个数并计算出 5个视野的穿膜细胞平均数。侵袭实验：将已包被Matrigel(与无血清培养基1∶5稀释)的孔径8 μm的小室置于 24 孔板的孔内。向小室的上室加入 200 mL 786-O细胞悬液，含 8×104个细胞。向小室的下室加入含10%胎牛血清培养基800 μL，将培养板置于37 ℃，5% CO2培养箱内培养24 h。处理方法同迁移实验，并拍照计数。

1.3统计学方法使用SPSS 18.0统计软件分析数据，采用双尾t检验比较两组数据，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1c-FOXP3表达水平与肾透明细胞癌患者预后有关528例肾透明细胞癌患者(来自TCGA数据库中的子库Human Protein Atlas)分为两组，其中183例患者低表达c-FOXP3，345例患者高表达c-FOXP3，生存分析结果示低表达c-FOXP3组的患者总生存率明显高于高表达c-FOXP3组，结果显示差异有统计学意义(P<0.05，图1)，提示c-FOXP3表达水平低的肾透明细胞癌患者，总生存率较高。

图1 低表达及高表达c-FOXP3的肾透明细胞癌患者的生存率比较(P<0.05)

2.2c-FOXP3敲低细胞的体外迁移能力受到抑制细胞划痕实验表明c-FOXP3敲低组细胞体外迁移能力较对照组减弱，Transwell小室迁移实验证实786-O及ACHN，c-FOXP3敲低组细胞穿过小室细胞数均少于对照组，统计分析差异有统计学意义(P<0.05，图2、图3)，由此推断c-FOXP3可能促进肾癌细胞的体外迁移能力。

2.3c-FOXP3敲低后细胞体外侵袭能力减弱Transwell小室侵袭实验表明c-FOXP3敲低组细胞穿过小室的细胞数明显少于对照组，统计学分析差异有统计学意义(P<0.05,图4)，由此推断c-FOXP3可能促进肾癌细胞的体外侵袭能力。

图2 c-FOXP3在肾癌细胞中的表达

A：Western blot法鉴定人肾癌786-O和ACHN细胞系中c-FOXP3存在高表达(×100)；B：Western blot法鉴定c-FOXP3敲低组细胞(KD)及对照组细胞(NC)在786-O和ACHN细胞系中c-FOXP3的敲低效率及其柱状图[其中ACHN的KD1 和KD2分别是两个c-FOXP3的敲低细胞株(KD2细胞株c-FOXP3的敲低效率较高，后续实验均使用KD2作为c-FOXP3敲低的ACHN细胞株)]。

图3 c-FOXP3可提高肾癌细胞的体外迁移能力

A：786-O和ACHN划痕实验中KD、NC组细胞体外迁移能力比较及其柱状图(c-FOXP3敲低组细胞体外迁移能力弱于对照组P<0.05)；B：786-O和ACHN Transwell小室迁移实验中KD、NC组细胞体外迁移能力比较及其柱状图(c-FOXP3敲低组体外迁移细胞数明显少于对照组，P<0.05)。

A：人肾癌细胞786-O的c-FOXP3敲低组细胞(KD)的体外侵袭能力明显低于对照组细胞(NC)；B：柱状图显示人肾癌细胞786-O的KD组细胞穿越基质层及小室的数目明显少于NC组(P<0.05)。

2.4c-FOXP3促进肾癌侵袭迁移相关蛋白的表达Western blot检测发现肾癌侵袭迁移相关指标N-cadherin和Vimentin在c-FOXP3敲低的786-O和ACHN组表达水平均较对照组低(P<0.05，图5)，由此推断c-FOXP3可能是促进肾癌侵袭、迁移的重要转录因子。

图5Westernblot检测间质细胞标志蛋白在c-FOXP3敲低的786-O和ACHN组(KD)及对照组(NC)细胞的表达水平及其柱状图

A:Western blot检测证实间质细胞标志蛋白N-cadherin和Vimentin均在c-FOXP3敲低的786-O和ACHN细胞中表达下调；B：柱状图显示N-cadherin和Vimentin在c-FOXP3敲低的786-O和ACHN组细胞(KD)中的表达水平均较对照组细胞(NC)减低(P<0.05)。

3 讨 论

KARANIKAS等[12]研究了25个不同组织来源的细胞株，包括肺癌、结肠癌、乳腺癌、黑色素瘤、红白血病、急性T细胞白血病等，结果发现 c-FOXP3的mRNA和蛋白质在所有肿瘤细胞株中均被检测到，仅表达水平不同，而与组织来源无关。c-FOXP3在不同肿瘤发展、演进中作用不尽相同，包括促进肿瘤演进，以及抑制肿瘤生长两个方面。对非小细胞肺癌患者的组织切片进行免疫组织化学染色，发现TNM分期较晚的患者中c-FOXP3阳性率较高，且c-FOXP3表达阳性的患者生存率明显低于阴性组[13]。在胃癌中有报道，c-FOXP3可与NF-κB相互作用而减少NF-κB与COX-2启动子的结合，进而影响COX-2的表达而发挥肿瘤抑制作用[14]。WANG等[15]发现趋化因子CCL5可以被c-FOXP3反式激活，从而由外周血向胰腺癌肿瘤微环境中招募更多的c-FOXP3+ 的Treg细胞，促进胰腺癌的演进。该研究提示，癌组织中表达的c-FOXP3可能作为重要的转录因子，调节趋化因子表达，进而向肿瘤微环境中招募炎症细胞，并促进肿瘤的演进。

通过对TCGA数据库分析，我们得知c-FOXP3在肾癌中的表达量与患者预后具有明显相关性，肾癌组织中c-FOXP3表达量相对较低的患者，临床预后较好。通过对常见肾癌细胞株进行c-FOXP3免疫印迹检测，发现786-O、ACHN和RCC42细胞中c-FOXP3表达水平较高。我们进而借助慢病毒感染技术建立了786-O和ACHN细胞的 c-FOXP3敲低细胞系，并进行了一系列癌细胞体外侵袭、迁移相关的生物学检测。细胞划痕实验和Transwell小室迁移实验表明，c-FOXP3敲低组肾癌细胞的迁移能力均较对照组下降；Transwell侵袭实验证实，c-FOXP3敲低组肾癌细胞的侵袭能力较对照组也有明显降低。由此我们可以看出，c-FOXP3作为转录因子，确实对肾癌侵袭、迁移这一肿瘤生物学行为具有促进作用。为进一步探讨分子机制，我们测定了肿瘤EMT相关蛋白标志物的表达，结果发现786-O及ACHN细胞系中，c-FOXP3敲低组细胞中N-cadherin和Vimentin表达水平均较对照组降低。c-FOXP3表达水平与“上皮-间质转化”(epithelial-mesenchymal transition，EMT)标志物的表达呈现同一变化趋势，提示肾癌的侵袭、迁移与c-FOXP3介导的EMT通路激活可能相关。

肿瘤转移是导致恶性肿瘤患者死亡的主要原因。新生血管形成在肾癌的演进中发挥重要作用，多项研究提示肥大细胞在肾癌组织中的浸润数目明显高于正常组织，肿瘤细胞分泌的多种趋化因子均可促进肥大细胞在肿瘤局部聚集。作为肿瘤微环境中重要成分的肥大细胞，可分泌一系列具有促进血管形成作用的活性因子，借鉴WANG等[15]的研究结果，我们认为c-FOXP3可能作为重要的转录因子，调节趋化因子表达，进而向肿瘤微环境中招募包括肥大细胞在内的多种炎症细胞，并促进肿瘤演进。除肿瘤微环境可能影响癌症演进，近年来以E-cadherin等上皮细胞标志物表达下调及功能缺失，同时N-cadherin、 Vimentin等间质细胞标志物表达上调为特征的EMT在肿瘤侵袭、转移研究中的作用受到越来越多的关注[16-17]。根据已有的研究表明，TGF-β、Wnt/β-catenin、 Notch、Hedgehog、IL-6/STAT3以及NF-κB等信号通路可诱导EMT进程。Snail1、Snail2、Twist1、Twist2、ZEB1和ZEB2等转录因子在EMT中发挥重要作用[18-19]。c-FOXP3作为重要的转录因子，其在NF-ΚB信号通路中的参与提示其可能对EMT有一定贡献，通过我们的实验初步验证了c-FOXP3通过某种机制促进N-cadherin和Vimentin的表达，从而促进肾透明细胞癌EMT进程。这一研究提示我们，c-FOXP3可能成为促进肾癌EMT的潜在转录因子，抑制c-FOXP3可能作为将来肾透明细胞癌治疗的新靶点。