猪睾丸(ST)细胞系作为猪瘟活疫苗生产用细胞基质的研究

任向阳 ， 吴文福 ， 岑小清 ， 刘秋燕 ， 游启有 ， 赖月辉

(1.广东永顺生物制药股份有限公司 ， 广东广州510623 ； 2.广州出入境检验检疫局 ， 广东广州510623)

猪瘟是由猪瘟病毒(CSFV)引起的猪的一种危害严重的烈性传染病，其特征为小血管的变性导致组织器官的多发性出血、坏死和梗死[1]。猪瘟严重危害我国养猪业并造成巨大的经济损失。疫苗免疫接种是我国预防控制猪瘟的主要措施[2-3]。采用牛睾丸原代细胞生产的猪瘟活疫苗对当时我国的猪瘟防控起到了重要作用。但因受到牛睾丸来源不均一、生产工艺不稳定等因素影响，导致生产的猪瘟活疫苗批间差异大、质量不稳定，且存在外源病毒污染的风险[4]。采用猪睾丸(ST)传代细胞生产猪瘟活疫苗在生产工艺、疫苗纯净性、病毒含量和质量稳定性等方面取得了显著突破[4-5]。本试验对猪睾丸(ST)细胞作为猪瘟活疫苗生产用细胞基质的可行性进行了探讨。试验方法和结果报告如下。

1 材料

1.1 试验细胞 猪睾丸(ST)细胞系，由中国兽医药品监察所提供，广东永顺生物制药股份有限公司传代、鉴定和保存。

1.2 对照细胞 阳性对照细胞：鼠神经胶质瘤细胞C6(18)。阴性对照细胞：鼠成纤维细胞NIH3T3。

1.3 试验用仔猪 来源于广东永顺生物制药股份有限公司实验动物场自繁自养的CSFV、PRV、PRRSV、PCV2、PPV抗原阴性且未接种过CSF疫苗的二元杂交仔猪。经猪瘟中和试验方法检测，选择猪瘟中和抗体阴性的25～30日龄健康易感仔猪。

1.4 攻毒用强毒 猪瘟强毒石门系血毒，由广东永顺生物制药股份有限公司制备、鉴定和保存。

2 方法

2.1 ST细胞系的培养 取ST细胞经胰酶-EDTA细胞消化液消化传代，以MEM生长液或维持液置36 ℃～37 ℃培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒。

2.2 ST细胞系的检验

2.2.1 纯净性检验 将ST基础细胞库细胞复苏，传代至F3作为待检细胞，记作ST(F3)细胞。复苏ST工作细胞库细胞，连续传代至F5、F10、F15、F20、F25和F30作为待检细胞，分别记作ST(F5)、ST(F10)、ST(F15)、ST(F20)、ST(F25)和ST(F30)细胞。观察不同代次待检细胞的生长特性，并按现行《中华人民共和国兽药典》对待检细胞进行细菌、真菌、支原体和外源病毒检验[6]。

2.2.2 致瘤性试验 取处于对数生长期的ST(F3)、ST(F5)、ST(F10)、ST(F15)、ST(F20)、ST(F25)和ST(F30)待检细胞和NIH3T3阴性对照细胞分别用PBS稀释成5×107/mL细胞悬液，每组分别接种裸鼠10只，每只背部皮下注射0.2 mL(含107个细胞)。取处于对数生长期的C6阳性对照细胞用PBS稀释成5×106/mL的细胞悬液，接种裸鼠10只，每只背部皮下注射0.2 mL(含106个细胞)。连续观察14日，检查有无结节或肿瘤形成。如果有结节或可疑病灶，继续观察1周，然后剖检，进行病理组织学检查。对未发生结节的动物，取其中半数裸鼠观察3周剖检，对另外半数裸鼠观察12周后剖检，观察各淋巴结和内脏器官中有无结节形成，对疑似者进行病理组织学检查。断颈处死裸鼠后，立即取瘤组织，经10% 福尔马林固定，制成石蜡切片。按照常规方法进行苏木素-伊红染色并观察结果。

2.2.3 胞核学检验 取对数生长期的ST(F3)、ST(F10)、ST(F20)和ST(F30)细胞分别加入Colchicine 0.2 μg/mL培养液，37 ℃作用3～7 h。D-Hank′s 洗一次，0.25% Trypsin消化，D- Hank′s洗一次，0.075M KCl 37 ℃低渗15 min，甲醇：乙酸(3∶1)固定3～4次，离心后少量固定液悬浮细胞，滴片，60 ℃干燥过夜，Giemsa染色10 min，水洗并空气干燥，二甲苯透明，封片。每组细胞分别观察50个处于有丝分裂中期细胞的染色体数。

2.3 ST细胞系繁殖猪瘟病毒的增殖试验 取处于对数生长期的ST(F5)、ST(F10)、ST(F15)、ST(F20)、ST(F25)和ST(F30)细胞，按3%接毒量分别接种同一批猪瘟毒种，接毒后5日作第一次收获换液，之后每隔4日收获换液1次。取一收至五收毒液分别用家兔测定其效价。将毒液用灭菌生理盐水作5×105倍稀释，每个稀释度分别接种家兔2只，每只耳静脉注射1.0 mL。接种后家兔体温反应标准与结果判定参考现行《中华人民共和国兽药典》。

2.4 ST细胞系繁殖的猪瘟病毒的免疫原性试验 取处于对数生长期的ST(F5)、ST(F15)、ST(F20)和ST(F30)细胞，按3%接毒量分别接种同一批猪瘟种毒，接毒后5日作第一次收获换液，之后每隔4日收获换液1次。将一收至五收的混合毒液用灭菌生理盐水作2×105倍稀释，分别接种无猪瘟中和抗体的25～30日龄健康易感仔猪5头，每头耳后颈部肌肉注射1.0 mL。接种14日后，连同5头条件相同的非免疫对照仔猪分别攻击猪瘟强毒，每头颈部肌肉注射猪瘟石门系血毒1.0 ml/头(含105MLD)。攻毒后每天观察临床症状，每天上、下午各测体温一次，连续观察16天，并统计分析攻毒结果。

3 结果与分析

3.1 生长特性观察及纯净性检验结果 ST(F3)、ST(F5)、ST(F10)、ST(F15)、ST(F20)、ST(F25)和ST(F30)细胞在pH值7.0～7.2的MEM营养液中，置37 ℃，含5% CO2条件下培养24～72 h，均可长成良好单层。经显微镜观察，上述各代次ST细胞长成良好单层时，均附着贴壁生长，折光性强，形态规则，细胞透明度大，没有空泡和融合细胞。上述各代次细胞经检验均没有细菌、真菌、支原体和外源病毒污染。

3.2 致瘤性试验结果 ST(F3)、ST(F5)、ST(F10)、ST(F15)、ST(F20)、ST(F25)、ST(F30)待检细胞和NIH3T3阴性对照细胞接种裸鼠观察21日均未出现结节或肿瘤形成(结果见表1)；取其中一半裸鼠于细胞接种后3周进行剖检观察，各淋巴结和器官均未出现结节或肿瘤形成；取另外一半裸鼠于细胞接种后12周进行剖检观察，各个淋巴结和器官均未发现结节或肿瘤的形成，也无移植瘤形成。而C6细胞接种的10只裸鼠，在接种2周后在其颈背皮下均可以观察到黄豆粒大小的肿瘤，随着时间的延长，肿瘤逐渐变大。取该瘤组织观察，可见瘤组织质韧、切面呈灰白色肉样。将瘤组织经福尔马林固定、制成石蜡切片进行H.E.染色后镜检，可见瘤组织内血管丰富，瘤细胞呈梭形，排列紊乱，核分裂旺盛，伴有异型核及病理性核分裂。

表1 各组细胞致瘤性试验结果

3.3 胞核学检验结果 经试验观察，在基础细胞库中存在的染色体标志，在ST(F10)、ST(F20)和ST(F30)细胞中均找到，ST(F10)、ST(F20)和ST(F30)细胞中的染色体模式数均未高于ST(F3)的15%(结果见表2)。上述结果符合生产用细胞系胞核学检验结果。

表2 不同代次ST细胞的胞核学检验结果

3.4 ST细胞系繁殖猪瘟病毒的增殖试验结果 取对数生长期的ST(F5)、ST(F10)、ST(F15)、ST(F20)、ST(F25)和ST(F30)细胞，按3%接毒量分别接种同一批猪瘟种毒，上述每个代次ST细胞繁殖的一收至五收细胞毒液效价均可达到5×105RID/mL(结果见表3)。

3.5 ST细胞系繁殖的猪瘟病毒的免疫原性试验结果 取处于对数生长期的ST(F5)、ST(F15)、ST(F20)和ST(F30)细胞为基质制备的猪瘟病毒分别接种无猪瘟中和抗体的健康易感猪5头，接种后未见任何不良反应，接种部位未出现肿块，免疫猪对猪瘟强毒的保护率均为100%(5/5)，免疫猪的精神、食欲、体温均无异常(结果见表4)。对照猪发病率100%(5/5)，均呈现典型的猪瘟临床症状，且有4头猪死亡，剖检均可见猪瘟特征性病变。

表3 不同代次ST细胞繁殖猪瘟病毒的增殖试验结果

表4 不同代次ST细胞繁殖的猪瘟病毒的免疫原性试验结果

4 结论

4.1 生物制品使用细胞基质的安全性一直是WHO关心的问题[7]。采用传代细胞系生产猪瘟活疫苗，应更加注重其传代稳定性和安全性。猪睾丸(ST)细胞系经过严格而全面的鉴定，并建立了基础细胞库和工作细胞库，安全纯净。 相对于采用牛睾丸原代细胞培养猪瘟病毒，减少了牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(BVD/MDV)等外源因子污染生产基质的可能。猪瘟兔化弱毒在ST细胞经过反复繁殖驯化试验，已研究出最适培养系统、培养工艺，确定了培养基的要求、细胞接毒剂量、收获时间和收获次数等技术参数。猪瘟病毒已适应于在ST细胞上繁殖。

4.2 ST细胞系在传代过程中形态良好，分裂能力强，无致瘤性且染色体遗传稳定。取不同代次的ST细胞繁殖猪瘟病毒液并测定其毒液效价；取不同代次的ST细胞繁殖的猪瘟病毒分别对猪进行免疫攻毒并测定其免疫原性。结果表明，将ST工作细胞传至第30代，其仍能良好地表达猪瘟病毒，产毒稳定，病毒滴度高，连续收毒，病毒产量高，且其所表达的猪瘟病毒仍保持良好的免疫原性。上述结果表明，猪睾丸(ST)细胞系传代稳定且安全，利用其制备的猪瘟病毒效价高且具有良好的免疫原性，符合猪瘟活疫苗生产用细胞基质的要求。

4.3 ST细胞系在传代过程中具有良好的生物学稳定性和纯净性，且以ST细胞系为生产基质繁殖的猪瘟病毒效价高并具有良好的免疫原性，为生产安全高效的猪瘟活疫苗提供了新的技术支撑。采用ST细胞系生产猪瘟活疫苗，生产效率高，生产工艺稳定；疫苗病毒含量明显提高，批间差异小，质量可控；疫苗安全性好，大大减少了免疫接种的应激反应；疫苗免疫效力好，可以减少母源抗体和其他病毒的混合感染对猪瘟活疫苗的免疫干扰作用；疫苗免疫效果确实，高水平的细胞免疫和体液免疫水平可以防止免疫猪的持续带毒，使猪瘟从源头得到控制[8-10]。