禽腺病毒4型hexon基因克隆与原核表达分析

王许航 ， 王 林 ， 经 美 ， 陈 萍 ， 王金凤 ， 孙继国,4 ， 刘聚祥,4 ， 王建昌 ， 袁万哲,4

(1.河北农业大学动物医学院 ， 河北保定071001 ； 2.北京市动物疫病预防控制中心 ， 北京大兴102600 ； 3.河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心 ， 河北石家庄050051 ；4.河北省兽医生物技术工程技术研究中心 ， 河北保定071001)

2015年6月以来，我国山东、安徽、河北、河南、辽宁等省份肉鸡群中发生了以心包积液、肝脏肿大为特征的疾病，根据病变，又将该病称为鸡心包积液-肝炎综合征。该病多发生于20～30日龄左右的肉鸡，发病后4～8 d为死亡高峰期，病程为8～15 d，死亡率达20%～30%。同时20～70日龄以及200～300日龄的蛋鸡也有发生，但是死亡率低于肉鸡。日前已经确定该病病原为Ⅰ群禽腺病毒4型(Fowl adenovirus 4, FAdV- 4)，且为高致病性毒株，可致死雏鸡[1-2]。目前，该病仍然发生与流行，给我国养鸡业造成了巨大的经济损失。

FAdV- 4基因组大小约为45 kb。病毒编码的主要结构蛋白有六邻体(Hexon)、五邻体、纤突等。其中Hexon蛋白带有属和亚属特异性抗原决定簇，可以刺激机体产生抗体。基于此，本研究对禽腺病毒4型SDSX1株的Hexon基因进行克隆并对其原核表达条件进行优化，获得了重组菌pQE1-hexon以及高纯度的Hexon蛋白，为进一步研究FAdV-4检测方法和新型疫苗奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料 禽腺病毒4型SDSX1株由本实验室分离并保存；2×TransTaq®HiFi PCR Super Mix I、ExnaseTMⅡ 和5×CE Ⅱ Buffer，购自武汉品生科技有限公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit，购自北京全式金生物技术有限公司；Rosetta2(DE3) pLySs、Top10感受态和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司;6×His,His-Tag Monoclonal Antibody，购自Proteintech公司；Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒，购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2 引物设计 根据GenBank上登录的SDSX1株基因序列(GenBank：KU845700)，应用Primer5.0软件设计1对特异性引物，在引物序列中引入5′ linker和3′ linker，便于后续与表达载体的重组反应。引物序列如下:上游引物P1：5′-GGGTCCAGCGGCGCTGGATCCATGGCGGCCCTCACGCCCGA-3′;下游引物P2：5′-CGCTCCACTGCCTCCTGCAGCTTACACGGCGTTGCCTGTGG-3′。预期扩增的片段大小约为2 856 bp，引物由生工生物工程(上海)技术服务有限公司合成。

1.3 病毒Hexon基因的扩增 利用EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取鸡胚分离毒SDSX1株的DNA，以此DNA为模板进行Hexon基因扩增。PCR扩增体系为：上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，PrimerSTAR Max(2x)25 μL，模板1 μL，加ddH2O补充至50 μL。PCR反应条件：98 ℃预变性1 min；98 ℃ 10 s，64 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min 20 s，共35个循环；72 ℃延伸2 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化目的基因。

1.4 表达载体pQE1的扩增 PCR扩增体系为：上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×TransTaq®HiFi PCR Super Mix I 25 μL，模板1 μL，加ddH2O补充至50 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，共35个循环；72 ℃延伸5 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化目的基因。用Nanodrop分别测定目的基因Hexon和表达载体pQE1的浓度。

1.5 重组质粒的构建 将Hexon目的基因与pQE1载体按一定比例进行重组，重组反应体系：ExnaseTMⅡ 1 μL，5xCEⅡBuffer 2 μL，Hexon目的基因3 μL，表达载体pQE1 4 μL。37 ℃反应30 min，冰上放置5 min，将10 μL重组产物转到Top10菌株，冰浴30 min，42 ℃ 90 s，冰上放置2～3 min，加入900 μL SOC培养基，37 ℃振摇1 h，离心后剩100 μL菌液涂含Kan+抗生素的LB板。菌液PCR鉴定，将阳性菌液送至测序，测序正确的质粒被命名为pQE1-Hexon。

1.6 重组质粒pQE1-hexon的原核表达 将阳性重组质粒pQE1-Hexon转化至Rosetta2(DE3)plysS感受态细胞中，将重组菌于37 ℃培养至OD600nm值约为0.6，加入IPTG，使其终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L，诱导表达5 h，确定最适的IPTG诱导浓度；在最适IPTG诱导浓度下，分别诱导表达0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h，确定最佳的诱导时间；在最适IPTG浓度和最佳诱导时间下，分别在20 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃诱导，确定最佳诱导温度。菌液经超声波破碎后，收集上清和沉淀进行SDS-PAGE检测。

1.7 Hexon蛋白的纯化 用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化蛋白, 用Nanodrop测定Hexon蛋白的浓度和纯度。

2 结果

2.1 目的基因PCR扩增 经PCR扩增的Hexon基因在大约2 800 bp处出现明显的目的条带，与预期的大小(2 856 bp)相符(图1)。表达载体pQE1在大约5 400 bp处有明显条带，与预期的大小(5 407 bp)相符(图2)。

图1 Hexon 基因的PCR扩增

M：DNA分子标准 ； 1：Hexon基因

图2 表达载体pQE1的PCR扩增

M：DNA分子标准 ； 1：pQE1基因

2.2 重组质粒pQE1-Hexon的菌液PCR鉴定 重组质粒pQE1-Hexon转入Top10菌株后，经菌液PCR鉴定，在大约2 800 bp处有明显条带，大小与预期的2 856 bp完全相符(图3)。

图3 重组质粒pQE1-Hexon 的菌液PCR鉴定

M：DNA分子标准； 1-6：pQE1-Hexon基因

2.3 表达产物的SDS-PAGE分析 SDS-PAGE分析表明，Hexon基因可得到表达，蛋白分子质量约为107 kD。Hexon蛋白在25 ℃、0.8 mmol/L IPTG条件下诱导4 h获得最大表达量，而未诱导的菌样未出现条带(图4～6)。可溶性分析表明，重组蛋白以不溶性的包涵体形式存在于菌体中(图7)。

图4 不同时间pQE1-Hexon诱导表达SDS-PAGE检测

M：蛋白分子标准；1：为pQE1-Hexon重组质粒未诱导表达时； 2-8：分别为pQE1-Hexon重组质粒诱导1、2、3、4、5、6、7 h后表达情况

图5 不同IPTG浓度pQE1-Hexon诱导表达SDS-PAGE检测

M：蛋白分子标准； 1-8：IPTG浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L时Hexon的表达情况

图6 不同温度 pQE1-Hexon诱导表达及可溶性SDS-PAGE检测

M：蛋白分子标准； 1～4：分别为20 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃时pQE1-Hexon诱导表达情况； 5：诱导表达 4 h时的沉淀； 6：诱导表达4 h时的上清2.4 重组Hexon蛋白的纯化复性 经Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化蛋白，纯化的蛋白经含GSH-GSSG的PBS复性缓冲液透析复性，复性条带大小与预期目的条带相符(图7)，用Nanodrop测定复性蛋白的浓度为5.165 mg/mL，纯度为97%。

图7 蛋白复性的结果

M：蛋白分子标准；1：纯化蛋白

3 讨论

Ⅰ群禽腺病毒是一种无囊膜的双链DNA病毒，呈球形，衣壳为20面体结构，直径约70～90 nm。病毒粒子主要由240个六邻体和12个五邻体基底(顶点壳粒)组成。每个五邻体有一条或两条纤突[3]，这些纤维以五邻体蛋白为基底由衣壳伸出[4]，在顶端形成头节区。五邻体和纤突的头节区可与细胞表面的病毒受体结合[5]，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。病毒粒子含有约14条多肽，主要有3个结构蛋白，分别为：六邻体蛋白、五邻体蛋白和纤突蛋白。禽腺病毒4型属于Ⅰ群禽腺病毒C种成员，其代表株ON1株通过肌肉注射感染SPF鸡，不能引起临床表现与病理损伤，为非致病性毒株[6]，而本项目组本次所分离的毒株却能引发SPF鸡死亡与病理损伤[1]，为高致病性禽腺病毒4型。目前尚无表达高致病性禽腺病毒4型Hexon蛋白的报道。

六邻体蛋白由3个相同的单体组成，其中部和C 端较保守，它是主要的结构蛋白，含有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的型特异性抗原决定簇。六邻体的前段和中段主要是由Loop1、Loop2及P1区组成，其比较大的抗原表位区都位于前段和中段，据此推测其具有型和群特异性表位，能诱导产生特异性抗体[7-8]。六邻体后端主要由Loop4、P2区组成，尽管该区域有较好抗原性，但疏水性氨基酸残基较多且暴露性差，说明该区域的总体抗原性较弱。因此，六邻体的前段和中段可作为蛋白表达首选区。本研究采用qRex重组酶体系方法，将高致病性禽腺病毒4型Hexon全长基因克隆至原核表达载体pEQ1中，获得了一种可高效表达蛋白的重组菌pQE1-Hexon以及高纯度的Hexon蛋白，为进一步研究FAdV-4检测方法和新型疫苗奠定了基础。