HPLC法同时测定山楂中展青霉素和5-羟甲基糠醛的含量

吴 仲 ，张 勋

（1.福建中医药大学药学院，福建福州350122；2.福建农林大学园艺学院，茶学福建省高等学校重点实验室，福建福州350002）

蔷薇科植物山楂适应性强[1]，在我国各地均有分布，常用作园林绿化植物[2]，其干燥果实作为一种药食同源的药材，含有丰富的生物活性物质[3-4]，具有健脾开胃、消食化滞等作用，在临床上有广泛的应用[5-6]。在休闲食品[7-8]、动物饲料[9-11]等领域的应用也越来越受到关注，推广山楂可谓兼具生态效应和经济效益[12]。展青霉素（Patulin）又称棒曲霉素，是曲霉属、青霉属、丝衣霉属等菌种的次级代谢产物，是一种神经毒素，具有潜在的致癌、致畸、致突变性，且可以稳定存在[13-15]。其在水果制品中广泛存在，山楂和山楂片中均有发现展青霉素的报道[16-17]。目前，GB 2761—2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》对山楂中展青霉素最高允许量做出了明确规定，而欧盟标准更加严格[17]。5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，HMF）主要由美拉德反应和己糖酸性条件下脱水产生[18]。HMF本身仅具弱毒性，但其能在体内形成具有强致癌和基因毒性的羟甲基糠醛次硫酸盐等[19-20]。如果山楂产品因加工或贮藏不当等原因产生HMF和展青霉素，可能会威胁消费者的身体健康。

因此，建立山楂中展青霉素和HMF的科学有效的检测方法，对于山楂制品质量安全显得尤为重要。目前，国内检测展青霉素和HMF采用HPLC法应用最为普遍[17，20]。HMF与展青霉素均带有羟醇、基，结构相似，简单的提取和净化过程中二者很难分离[21]。

为有效分离展青霉素和HMF，本研究尝试采用20%乙腈提取，Myeosep@228AflaPat柱净化，以建立一种专属、准确、能同时检测HMF和展青霉素含量的测定方法，为山楂质量控制提供试验依据，保障其食用安全。

1 材料和方法

1.1 材料

5份供试山楂样品从当地不同超市购买，常温放置72 h，60℃干燥，粉碎。

1.2 试剂

展青霉素/棒曲霉素标准品（批号：O14099，山海安浦实验科技股份有限公司）；5-羟甲基糠醛（批号：H810986，上海麦克林生化科技有限公司）；甲醇、甲酸、乙腈均为色谱纯（默克化工技术有限公司）；试验用水皆为实验室自制二次蒸馏水。

1.3 主要仪器

多功能高速粉碎机（型号：BO-100T，永康市铂欧五金制品有限公司）；电子天平（型号：AR224CN，奥豪斯仪器（常州）有限公司）；数控超声清洗器（型号：KQ-500DE，昆山市超声仪器有限公司）；涡旋仪（型号：VOREX-5，海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；Myeosep@228AflaPat柱（批号：228088-1512，浙江月旭材料科技有限公司）；Waters e2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；NEVAP-12氮吹仪（美国Orgranomation公司）；一体化超纯水机（型号：MILLI-QDirect16，美国Millipore公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 色谱条件 色谱柱：Ultimate@XB-C18（4.6nm×250 nm，5 μm），流动相洗脱条件为等度洗脱乙腈-0.02%甲酸（13∶87）溶液；流速为 1 mL/min；柱温为30 ℃，进样量为 10 μL。

1.4.2 标准品溶液的配制 展青霉素—5-羟甲基糠醛混合标准品储备液：精密称量并配制100μg/mL展青霉素、125 μg/mL HMF标准品母液，分别量取1 mL展青霉素标准品母液和1.6 mL HMF标准品母液于10 mL容量瓶中，加乙腈适量溶解并稀释至刻度，摇匀，制得展青霉素质量浓度为10 μg/mL和HMF质量浓度为20 μg/mL的标准品储备液。

1.4.3 供试品溶液的配制 精密称取山楂样品粉末1 g，置25 mL容量瓶中，用20%乙腈溶液定容至刻度，称质量，400 W功率超声提取5 min，提取温度为40℃，冷却后再称质量，用20%乙腈补足至原质量，摇匀后静置片刻，取约10 mL上清液于净化柱玻璃试管中，将净化柱插入试管中，至上而下缓慢推进，净化后的样品提取液经吸附剂进入柱子的上端，精密量取4 mL净化后的提取液于试管中，微弱氮气吹至近干，加入20%乙腈水溶液至2 mL后涡旋振荡30 s，用0.45 μm滤膜过滤，即得供试品溶液。

1.4.4 检测波长的选择 将混合标准品稀释液在200～450 nm的波长范围内进行光谱扫描，以确定检测波长。

1.4.5 流动相的选择 将流动相甲酸设0.02%，0.05%等2个浓度，比较其对展青霉素和HMF色谱峰型的影响。

1.4.6 提取溶剂的选择 将提取溶剂甲醇、乙腈分别设10%，20%，40%，60%，80%等不同浓度，比较其对超声提取HMF和展青霉素效果的影响。

1.4.7 净化柱的选取 采用Myeosep@228AflaPat柱进行净化，与不使用净化柱相比较，分析其对测定山楂中展青霉素和HMF含量准确性的影响。

1.4.8 标准曲线绘制 精密吸取混合标准品储备液1 mL于10 mL量瓶中，20%乙腈定容，依次对半稀释得9组不同浓度的标准品混合液，编号1～9。进样量为10 μL，按照1.4.1的液相色谱条件进行测定。以标准品溶液的浓度（C，μg/mL）为横坐标（X），液相色谱峰的平均峰面积（A，mAU）为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得到回归方程和相关系数。

1.4.9 精密度试验 取母液稀释10倍混合标准品溶液（其中展青霉素、HMF的质量浓度分别是10，20 μg/mL）10 μL，进行测定。一天内连续进样 6 次，记录峰面积。

1.4.10 稳定性试验 取1份山楂样品制备供试品溶液，室温环境下分别在 0，2，4，6，8，10，12，24，48 h时进样10 μL，进行测定。

1.4.11 重复性试验 取同批山楂样品6份，1份1 g，按供试品制备方法制备供试品溶液，进行测定。

1.4.12 加样回收率 取山楂样品6份，1份1 g，分别加入3个质量浓度的标准品混合液（每个浓度3份），依法进行测定，平行测定3次，计算平均回收率及RSD值。

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

混合标准品稀释液在200～450 nm的波长范围内检测，HMF的吸收峰峰位在282 nm附近，展青霉素的吸收峰峰位在276 nm附近。检测波长设定在280 nm时，二者均可出峰，且峰面积较其他波长大，干扰组分的影响也较小，所以，本研究确定检测波长为280 nm。

在标准品色谱（图1）上，各对照品色谱峰理论塔板数均＞5 000，并且拖尾因子均＜2.0；在供试品色谱（图2）上，HMF和展青霉素色谱峰与相邻色谱峰的分离度均＞2.0，表明本法可用于HMF（峰A）和展青霉素（峰B）的检测。

2.2 流动相的选择

由图3，4可知，0.02%的甲酸可以防止展青霉素和HMF拖尾，峰型较佳，故选择乙腈-0.02%甲酸做为流动相。

2.3 提取溶剂的选择

试验发现，不同浓度甲醇提取的展青霉素出峰情况不佳；当乙腈浓度在10%～20%时，乙腈浓度与展青霉素、HMF的提取率呈正相关，而40%的乙腈提取率反而低于20%的乙腈提取率，因此，选择20%的乙腈作为展青霉素和HMF提取溶剂。

2.4 净化柱的使用

净化柱使用前后色谱峰如图5，6所示，结果显示，采取Myeosep@228AflaPat净化柱后展青霉素和HMF的吸收峰更高。展青霉素和HMF在山楂中为痕量存在，净化处理能更准确地测定其在山楂中的含量。

2.5 标准曲线绘制

展青霉素和HMF的回归方程和相关系数如表1所示，结果表明，二者在线性范围内线性关系良好。

表1 标准品的线性回归方程

2.6 精密度试验

精密度试验结果表明，展青霉素、HMF峰面积的RSD分别为0.53%，0.51%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

稳定性试验结果表明，展青霉素、HMF峰面积的RSD分别为2.23%，5.54%，表明山楂供试品溶液中展青霉素和HMF在48 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验

重复性试验结果表明，展青霉素、HMF峰面积的RSD分别为1.03%，1.20%，表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率

加样回收率试验结果列于表2。由表2可知，展青霉素、HMF平均回收率分别为104.01%，100.93%；RSD值分别为1.06%，1.03%，表明该法回收率较理想，适合样品的处理。

表2 加样回收率试验结果（n＝3）

2.10 样品检测

所有山楂样品测定后，按外标法计算HMF和展青霉素的含量，结果列于表3。目前，我国仅规定了蜂蜜中HMF的限量为40 mg/kg，其他食品尚未明确制定限量标准，而欧盟食品安全委员会认为，每人每天摄入HMF的上限为1.6mg[19]。GB2761—2017规定以苹果、山楂为原料制成的食品中展青霉素的为限量50 μg/kg。结果表明，市售山楂可能会因贮藏不当等原因存在HMF和展青霉素的污染风险，以山楂为原料进行休闲食品、保健食品的开发需强化HMF和展青霉素的质量控制。

表3 市售山楂中HMF和展青霉素的含量 μg/g

3 结论

本研究采用HPLC法测定山楂中展青霉素和HMF，以乙腈-0.02%甲酸做为流动相，在280 nm波长处检测，结果表明，该法能有效分离二者，采取Myeosep@228AflaPat净化柱处理基本能消除脂肪等有机质对检测的干扰，该方法的精密度、稳定性和线性关系均满足分析检测的要求。以这种方法检测山楂中展青霉素和HMF，可满足对其进行质量控制的要求。