银纳米粒子的SERS效应和SEF效应在微流控芯片光学检测中的应用

郭 威， 吴 坚*， 王春艳， 陈 涛

( 1. 北京工业大学 激光工程研究院， 北京 100124；2. 中国航天员科学研究训练中心 航天医学基础与应用重点实验室， 北京 100094)

1 引 言

作为多学科交叉前沿技术，微流控芯片技术可以用来检测无机离子、有机物质、生化组分等，具有自动化程度高、试剂用量少、污染少的优点。目前微流控的研究主要集中在生物学应用上，但其在化学、流体物理、新材料等领域都有广泛的应用。微流控芯片技术主要包括微流控芯片制作、微流体驱动、温度控制、荧光检测等，其中微流控芯片的检测方法是微流控技术的关键技术之一，目前应用较为广泛的是光学检测方法。在微流控芯片微通道中检测到的荧光由于样品量小造成激发出的荧光十分微弱，这使得光学检测变得十分困难。表面增强拉曼(Surface enhanced Raman scattering,SERS)作为独特的检测技术被引入到微流控芯片的光学检测中，且在近十年得到快速发展。SERS效应是指当分子被吸附在金属表面或溶液中时，样品表面或近表面的电磁场增强使得其拉曼散射信号强度得到极大增强。这种技术由Fleishmann等于1974年首次发现[1]，该技术现已逐渐成为单分子测量的重要手段[2-4]。SEF效应原理与SERS相似，由于金属纳米粒子的表面等离子体共振特性，周围电磁场的强度得到极大增加，进而影响吸附于其表面及附近荧光物的发光特性，最终使得荧光强度得到成倍的提高。在Lakowicz团队对SEF现象进行了大量研究并完善了SEF理论模型后[5]，SEF逐渐得到了研究人员的重视，被应用在生物传感和光谱检测研究中。Novotny等的研究工作证明表面增强荧光强度会随分子-金属表面间距的变化而发生改变[6]。单体水平的研究在许多方面正逐渐成为研究微纳光子学问题的独特方式[7-8]，但是其荧光增强最高只有8倍左右。Kinkhabwala等[9]首次实验报道了3个数量级以上的荧光增强效果。最近，法国Wenger教授研究组[10]提出了一种二聚体内嵌于微孔的新型光学天线，该结构的表面荧光增强达约1 100倍。国内也有文献报道了SEF的特性研究，刘丽双等研究了Ag 纳米颗粒的质量浓度对拉曼与荧光光谱强度的影响[11]，徐良敏等研究了金属表面荧光增强的物理增强机制[12]，董军等研究了抛光金属银表面的罗丹明6G荧光增强效应[13]。多种特定尺寸的金属纳米粒子都可以产生SERS效应和SEF效应，其中金纳米粒子和银纳米粒子应用较为广泛。

为了改善微流控芯片光学检测中遇到的荧光信号微弱问题，我们提出使用一种在微通道中增加银纳米粒子、利用其产生的SERS效应和SEF效应实现改善荧光素SYBR GreenⅠ混合液检测结果的方法，SYBR GreenⅠ是一种可被475 nm的光所激发的荧光染料，激发后结合双链DNA的SYBR GreenⅠ会发射530 nm左右的荧光，这种特性使得其可被应用在生物检测中。我们通过在微流控芯片微通道中添加银纳米粒子后实现SYBR GreenⅠ混合液SERS和SEF信号的增强，并分别对SERS增强效果和SEF增强效果进行了检验和分析。

2 实 验

2.1 聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)基板上的微流体芯片的制造

首先将PMMA切成片，用超声波清洗器在去离子水中清洗，随后在加压空气流下干燥。微流控芯片的微通道加工使用准分子激光直写系统对片状PMMA进行直写刻蚀，准分子激光器工作气体为 KrF，波长为248 nm，入射能量为8 J/cm2，加工方式为冷加工。光束平移速度为10 mm/min，同时，利用0.3 MPa的压缩空气在刻蚀的同时清洁PMMA基板的表面，以避免灰尘的形成。制造装置如图1所示，制作出的微流控芯片微通道宽度约为200 μm，深度约为68 μm。

图1 微流体芯片制作示意图

2.2 银前体溶液及SERS与SEF基板的制备

在室温下将1 g剂量的乙酸银混合到2.5 mL氢氧化铵水溶液中，静置15 s，然后将甲酸(0.2 mL)逐滴滴入溶液中。将溶液放于桌上静置12 h，使大颗粒充分沉降，使用200 nm针筒式过滤器过滤。

使用微量注射器抽取前体溶液，将溶液滴入微通道的微小区域，然后将微流体芯片放在设置有不同温度的加热平台上。加热15 min后，产生银纳米颗粒并吸附在微流体芯片的通道中。使用去离子水冲洗掉过量的银纳米颗粒，获得基于SERS与SEF的微流体系统，用于检测SYBR GreenⅠ荧光染料。

有研究已经证明纳米粒子的大小和形状会对表面等离子体共振特性产生重要影响，进而影响表面增强拉曼的增强效率，当粒子的尺寸小于入射光的波长、同时大于电子平均自由程时可以得到较好的增强效果，粒子的最佳尺寸为10～100 nm[14-15]。为此我们准备不同尺寸的纳米粒子进行试验。银纳米粒子的制备主要分为两个过程：成核阶段和生长阶段。决定纳米晶形状的关键因素之一就是成核阶段中的反应环境，特别是反应温度，控制反应初始阶段的温度是至关重要的，直接影响着晶体的生长情况。为了获得不同大小的银纳米粒子，我们分别在4种不同的温度下(90，80，70，60 ℃)进行基板的制备实验。

图2为SERS与SEF基板的制备示意图，加热平台温度在4次制作过程中分别控制在90，80，70，60 ℃；图3为制作的实物局部图片，实际制作的基板大小为40 mm×65 mm×1 mm。

图2 SERS与SEF基板的制备示意图

图3 基板实物局部照片

3 结果与讨论

图4显示了不同温度下在微流体通道中获得的银纳米粒子的扫描电镜图像。在图4(a)中，当温度为90 ℃时，制备的银颗粒的粒径约为1 μm。通过图4可以看出纳米粒子尺寸随温度的降低逐渐减小，当温度降到60 ℃时，纳米颗粒的尺寸减小到几十个纳米(图4(d))。

图4 在不同温度下的微流体中获得的银纳米颗粒的SEM尺寸图。(a)90 ℃；(b)80 ℃；(c)70 ℃；(d)60 ℃。

为了研究银纳米粒子(制备温度为60 ℃)SERS和SEF效应对SYBR GreenⅠ混合液的信号增强效果，我们使用激发波长为532 nm的拉曼设备(HR Evolution，HORIBA JOBIN YVON，法国)用于SERS 信号的检测，使用自制的荧光检测装置(原理与Thermo Fisher公司的Qubit®3.0荧光计相同)对SEF信号进行检测。图5为相同银纳米粒子浓度(2 mmol/L)下SYBR GreenⅠ混合液拉曼光谱和表面增强拉曼光谱测量结果，可以看出加入银纳米粒子后测量的信号与未加入银纳米粒子相比得到显著增强。拉曼散射强度的增加由两个方面的因素引起：一是吸附在银纳米粒子表面的SYBR GreenⅠ荧光分子之间的相互作用，二是粒子表面的等离子体共振作用。由于溶液中存在一定表面粗糙度的银纳米粒子，入射光产生的电磁场被明显增强，而拉曼散射强度正比于分子所处光电场强度的平方值，使得吸附在银纳米颗粒表面的分子产生拉曼散射的几率得到极大增加，最终表面拉曼强度检测值得到了增强，实验中增强因子约为3.5×103。图6显示了相同银纳米粒子浓度(2 mmol/L)下SYBR Green Ⅰ 混合液的荧光光谱和表面增强荧光光谱对比结果，每组样品测量5次，误差范围为5%，在可接受范围内。由图6可看出荧光信号强度在添加银纳米粒子之后约增强了一倍。根据经典电磁理论，电偶极子的方向和强度取决于两个方面，一是激发光场的偏振方向和强度，二是入射光场方向的变化。在银纳米粒子的表面和荧光分子附近，等离子体振荡电场的方向与激发场的方向是保持一致的，激发态荧光分子所激发的等离子体振荡也增强了荧光分子周围的激发态局部电场，最终使得荧光强度增强。

图5 SYBR GreenⅠ的拉曼值和表面增强拉曼值

图6 SYBR GreenⅠ的荧光值和表面增强荧光值

图7显示了在不同银纳米粒子稀释浓度下SYBR GreenⅠ混合液的SERS增强结果，图8显示了不同银纳米粒子稀释浓度下SYBR GreenⅠ混合液的SEF增强结果，可以看出，不同浓度银纳米粒子下的SYBR GreenⅠ混合液都可以获得增强的信号，也说明本方法用在SYBR GreenⅠ的检测时检测结果可以得到可靠的提高，该方法在实时监测聚合酶链反应(PCR)中具有很大的潜力。

图7 不同Ag纳米粒子浓度SYBR GreenⅠ的SERS增强结果

图8 不同Ag纳米粒子浓度SYBR GreenⅠ的SEF增强结果

4 结 论

SYBR GreenⅠ是生物芯片检测中常见的标记物，研究SYBR GreenⅠ的检测信号的增强，对提高微流控芯片中PCR荧光总量检测灵敏度是非常有意义的。我们提出一种在微流控芯片微通道中添加一定尺寸的银纳米粒子来提高检测结果的方法。在检测SYBR GreenⅠ时通过增加银纳米粒子显著增强拉曼和荧光信号，SERS实验的增强因子为3.5×103，添加银纳米粒子的样品的荧光信号强度与不含银纳米粒子样品的荧光信号强度相比，约增加了1倍，这种方法可以用于微流控芯片中SYBR GreenⅠ的SERS和SEF定量检测。