抛物线布点法在滩涂贝类养殖区微生物监测中的应用

陈 瑜，张小军，严忠雍，何依娜，许 丹

(浙江省海洋水产研究所 浙江省海水增养殖重点实验室，浙江 舟山 316021)

微生物是港湾生态系统的重要组成部分, 在物质循环和能量流动中发挥着重要的作用，其数量及生物多样性可以作为海洋环境监测的生物学指标。港湾生态系统相对独立，在水动力等自然条件作用下，受海洋开发活动及外来污染影响尤为突出，由于人类对港湾资源的过度开发利用，沿湾地区环境污染日趋严重，直接引起病原微生物的大量滋生，破坏港湾生态系统平衡。贝类是一种非选择滤食性生物，在生长过程中易积累和富集环境中的病原微生物[1]。富集的微生物通过食物链转移到人体内，会严重危害身体健康[2]。因此，开展滩涂贝类及生长环境的微生物监测以及贝类养殖环境评价[3]，对滩涂贝类养殖业的健康持续发展及贝类食品安全具有重要的意义[4]。

农业部渔业局从2003年起，对我国主要贝类养殖海区的环境状况以及养殖贝类卫生状况进行了分类管理工作[5]。同时，经过多年的贝类划型工作和长期的总结经验发现：贝类监测点的布设决定着监测数据能否有效地反映研究区域的环境质量状况，是贝类监测和划型的重要一环，但对于不同类型的养殖生产海域还没有明确的监测站位布设原则和方法。因此，本研究根据乐清湾北部贝类养殖生产区所属海域，提出了港湾滩涂贝类养殖生产海域监测站位布设原则和方法，并对建立的监测站位布设原则和方法进行验证和结果评价，为完善贝类划型工作方案提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

隔水式恒温培养箱(型号GHP-9270)；智能光照培养箱(型号(GXZ)；生物安全柜(型号 BSC-1000ⅡA2)；立式压力蒸汽灭菌锅(型号YXQ-LS-50G)；其他实验室常用设备。

1.2 培养基及试剂

月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤、EC肉汤(E.coli broth)、伊红美蓝(EMB)琼脂、营养琼脂、平板计数琼脂(PCA)、2216E琼脂、乳糖蛋白胨培养基、HBI生化鉴定试剂盒，均购自青岛海博生物技术有限公司。所有培养基均需121 ℃高压灭菌20min；其余为实验室常用试剂。

1.3 贝类监测点确定及试验方法

1.3.1 监测点的确定

本研究以乐清湾北部为贝类研究海域，即乐清湾以北开展贝类产品采样布点。并以北纬28.278 N为横轴，东经121.186 E为纵轴，港湾顶端为抛物线顶点，沿港湾海岸线画抛物线。其中X轴标尺约850 m，Y轴标尺约710 m。以坐标轴0为中心，每一个X轴标尺为横坐标在抛物线上布点，如图1。此时，有15个监测点被初步确定，但由于不是所有的点都是贝类养殖点，通过对滩涂贝类实际养殖情况的调查研究，13个监测点被最终确认。如图2。监测点具体坐标及地理位置如表1所示。

对于以上选取的13个监测点，分别于8月、9月和10月进行3个批次的缢蛏样品抽样检测，每个样品做三个重复。

采集的缢蛏分别放置在无菌的拉链袋中，然后在4 °C保存，在采集后24 h内进行处理，在实验室中用干净的自来水冲洗，用75%消毒棉球擦洗，用无菌钳打开。

1.3.2 贝类大肠杆菌和菌落总数的检测

大肠杆菌按照GB4789.38-2012食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数。将贝类撬壳称取25 g 肉，放入盛有225 mL磷酸盐缓冲液中均质，制作成1∶10的样品匀液。选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种3管，然后放入培养箱中培养。经过初发酵、复发酵和生理生化试验，计数阳性管数，查MPN 表。

菌落总数按照GB4789.2-2010食品微生物学检验菌落总数测定。将贝类撬壳称25 g肉，放入盛有225 mL磷酸盐缓冲液中均质，制作成1∶10 的样品匀液。然后，选择合适的3 个稀释度，每个稀释度做2个平板，用灭菌冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后，将平板翻转，( 30±1) ℃培养( 72±3) h。选择菌落数在30～300 CFU之间连续两个稀释度的平板，按公式计算样品中均落数。

图1 初定贝类监测点

监测点经纬度地理位置1E 121°06.922 N 28°16.697乐清市清江镇2E 121°08.233 N 28°18.126乐清市清江镇3E 121°08.712 N 28°19.590乐清市雁荡镇4E 121°10.053 N 28°20.671乐清市雁荡镇5E 121°10.755 N 28°22.313乐清市大荆镇6E 121°11.301 N 28°22.915乐清市湖雾镇

表1(续)

1.4 海水监测点确定及试验方法

1.4.1 海水监测点确定

布点方法参照贝类产品抛物线，以北纬28.278 N为横轴，东经121.186 E为纵轴，港湾顶端为抛物线顶点，沿港湾海岸线画抛物线。以坐标轴0为中心，每隔三个X轴标尺为横坐标在抛物线上布点，得到7个海水监测点(1，3，4，6，7，8和10)，同时，在坐标轴Y轴上取3个监测点(2，5和9)做对照，最终10个海水监测点被确定，如图3。

分别于8月、9月和10月对以上选取的10个海水监测点进行3个批次的海水样品抽样检测，每个样品做三个重复。

图3 海水站位监测点

监测点经纬度1E 121°07.512 N 28°16.6802E 121°11.160 N 28°16.6803E 121°14.327 N 28°16.6804E 121°08.905 N 28°19.4765E 121°11.160 N 28°19.4766E 121°13.293 N 28°19.4767E 121°10.164 N 28°20.7258E 121°13.174 N 28°20.7259E 121°11.160 N 28°21.67010E 121°11.160 N 28°22.796

1.4.2 海水粪大肠菌群和细菌总数的测定

海水中粪大肠菌群和细菌总数的检测按照GB17378.7-2007海洋监测规范第7部分近海污染生态调查和生物监测。

粪大肠菌群的检测。将3个适宜梯度的的海水样品接种到44 ℃乳糖蛋白胨肉汤中，每个梯度接种5管，置于恒温培养培养24 h，将有产酸和产气迹象的乳糖蛋白胨管传代到EC肉汤中进行复发酵试验，在恒温培养箱44±0.5 ℃下培养24 h。在此期间产酸且产气的即为阳性管，通过查表得粪便大肠菌群MPN值。

菌落总数的检测。以无菌操作吸取1ml水样注入盛有9mL灭菌陈海水的试管内混合，并依同法依次连续稀释至所需要的稀释度(倍数)。稀释度依水样含菌量而定，选择合适的3 个稀释度，每个稀释度做2个平板，用灭菌冷却至25 ℃的2216E琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后，将平板翻转，25℃培养7d。选择菌落数在30～300 CFU之间连续两个稀释度的平板，按公式计算样品中均落数。

1.5 数据分析

所有数据都经过lg X转化，统计分析实验数据，最后通过EXCEL做图。

2 实验结果与分析

2.1 贝类样品微生物监测结果分析

从大肠杆菌分布图(图4)可以看出，缢蛏样品中大肠杆菌的数量沿乐清湾北部沿岸呈类似抛物线分布。大肠杆菌的数值在乐清湾顶部缢蛏样品中表现最高，并且沿贝类河床往下呈减少趋势。其中，监测点5，6，7和8抽取的缢蛏样品中大肠杆菌的数值显著性高于其它监测点，而且在三次监测中均超出二类贝类生产区4600 MPN/100 g的限值。另外，监测点1(包含三个批次)和监测点10(包含两个批次)的缢蛏样品中大肠杆菌的数值也都超过了4600 MPN/100 g的限值。其它监测点的缢蛏样品大肠杆菌数值均未超过4600 MPN/100 g的限值。

从菌落总数分布图(图5)可以看出，与大肠杆菌分布相似，缢蛏样品中菌落总数的数量也呈类似抛物线分布。处于抛物线顶端的监测点5，6，7和8抽取的缢蛏样品中菌落总数的数值显著性高于其它监测点，此外，监测点1和监测点10的缢蛏样品中菌落总数的数值也相对偏高。因此，缢蛏中大肠杆菌与菌落总数的数值呈一定的正相关。

图4 不同站位大肠杆菌数量(8～10月)

Fig.4 The numbers of E.coli within S.constricta flesh fromdifferent sampling sites,over differing temporal scales (from August to October)

图5 不同站位菌落总数数量(8～10月)

Fig.5 The numbers of ACC within S.constricta flesh from different sampling sites,over differing temporal scales (from August to October)

2.2 海水样品微生物监测结果分析

从粪大肠菌群分布图(图6)可以看出，位于乐清湾顶部(即抛物线顶点附近)监测点7～10采集的海水样品中，粪大肠菌群的数量显著性高于其它监测点。相反地，监测点2～6海水中粪大肠菌群的数值较低。然而，监测点1的海水却表现出较高含量的粪大肠菌群。结合贝类监测点采集的数据，我们发现缢蛏中大肠杆菌与海水中粪大肠菌群的含量呈一定的正相关。另外，通过对比同一纬度线上三个点(1, 2, 3 和 4, 5, 6)，粪大肠菌群数值呈现中间低两边高的趋势，即位于中间监测点采集的海水比沿岸监测点采集的海水粪大肠菌群数值相对较低。一些研究已经证明，地表径流、污水排放和港口开发等都会直接导致近岸海域海水粪大肠菌群含量的增加。因此离沿岸和人类生活区距离越近其海水中粪大肠菌群数值就越高，这与本研究的结果一致。此外，监测点1位于清江入海口，监测点8位于江厦排捞隧洞入海口，这两个监测点更容易受污染而表现出高含量的粪大肠菌群。

分析细菌总数分布图(图7)，没有发现显著性的规律，而且海水中细菌总数和粪大肠菌群的含量并没有显示相关性。

图6 不同站点海水粪大肠菌群数量(8～10月)

Fig.6 The numbers of faecal coliform within seawater samples from different sampling sites,over differing temporal scales (from August to October)

图7 不同站点细菌总数含量(8～10月)

Fig.7 The numbers of TBC within seawater samples from different sampling sites,over differing temporal scales (from August to October)

3 乐清湾贝类产区划分分析

港湾的海水交换能力是海水微生物含量一个重要的影响因素，海水的交换速率直接决定了海水的自净能力[6]。在本研究中，贝类监测点5，6，7 和 8位于乐清湾的顶端，其海水交换速率相对较慢，因此，该区域海水和贝类中粪便指示菌的含量要显著性高于其它监测点。监测数据也显示了该区域采集的缢蛏样品其大肠杆菌含量显著性偏高，而且超过了二类生产区4600 MPN/100g的限值。依据(农渔发[2016]8号)文件和三次贝类监测数据，我们建议以监测点8为界，即28.367 N以北的乐清湾北部海区划为三类贝类生产区[7]，如图8。一些研究表明当长期暴露于受污染的海水环境中时，贝类会富集高浓度的粪便病原菌[8-9]。在本研究中，贝类监测点1和10位于江河入海口，因此该区域贝类生长海水极易受生活污水、养殖尾水、工业废水和生产活动等的影响。监测数据也显示了在采集的缢蛏样品中，来自监测点1的三个批次和监测点10的两个批次的缢蛏样品其大肠杆菌数值过了二类生产区4600 MPN/100g的限值。然而，对于该区域附近的其它监测点，采集的三批次缢蛏样品均未超过4600 MPN/100g。因此，综合考虑，将28.367 N以南，28.278 N以北的乐清湾北部海域划为二类贝类生产区，同时要重点加强对贝类监测点1和10的监测，如图8。

图8 乐清湾贝类产区划分示意

4 结论

本研究将抛物线定点法初步运用于港湾滩涂贝类养殖生产海域的贝类及生长海水站位布设。研究表明，缢蛏样品大肠杆菌和菌落总数的数量沿乐清湾北部沿岸均呈类似抛物线的分布，其数值在乐清湾顶部采集的缢蛏样品中显示最高，并且沿贝类河床往下呈减少趋势。且大肠杆菌与菌落总数的数值呈一定的正相关。同时，我们发现缢蛏大肠杆菌与海水粪大肠菌群的含量也呈一定的正相关。另外，通过对比同一纬度线上三个点，粪大肠菌群数值呈现中间低两边高的趋势，即位于中间监测点采集的海水比沿岸监测点采集的海水粪大肠菌群数值相对较低。分析细菌总数含量分布图，没有发现显著性地规律。最后，依据(农渔发[2016]8号)文件和三次贝类监测数据，综合考虑将8.367 N以北的乐清湾北部海区划为三类贝类生产区，将28.367 N以南，28.278 N以北的乐清湾北部海域划为二类贝类生产区，同时要重点加强对贝类监测点1和10的监测。