落羽杉属树种赤枯病发生规律及其防治药剂筛选

冯 婷， 张 凡， 殷云龙， 韩正敏， 华建峰， 於朝广

(1.江苏省中国科学院植物研究所，江苏南京 210014； 2.南京林业大学，江苏南京 210037)

落羽杉属(TaxodiumRich.)属于杉科(Taxodiaceae)，属内主要分3个种，落羽杉[Taxodiumdistichum(Linn.)Rich.]、池杉(T.ascendensBrongn.)和墨西哥落羽杉(T.mucronatumTenore)[1-2]。中山杉(Taxodium‘Zhongshanshan’)主要是落羽杉、墨西哥落羽杉、池杉3个树种种间杂交得到的优良无性系的总称[3]，因其兼具生长快、耐盐碱、耐水淹、成材率好、常绿性优、观赏价值高等落羽杉属树种的优点，现成为我国南方低洼湿地造林的优选树种[4-6]。然而，近年来随着种植面积的扩大，赤枯病害问题也日益突显。

赤枯病是杉科树种生长过程中容易发生的真菌性病害。其中水杉和杉木赤枯病的研究报道较多，水杉赤枯病的病原菌主要为拟盘多毛孢(Pestalotiopsissp.)、链格孢(Alternariasp.)和炭疽菌(Colletotrichumsp.)[7-8]。病原菌在水杉表皮组织上以菌丝体越冬，次年3月底至5月上中旬遇上风雨产生分生孢子，借助风雨传播侵染。该病先从水杉的中下部枝叶表现发病，逐渐向上扩展蔓延，严重发生时导致全株枯死。感病叶逐渐呈深褐色，生有灰黑色的绒状小点，并易脱落。高温湿度大的条件下有利于它的侵染蔓延[9]。研究表明，水杉赤枯病的防治主要选用80%多菌灵、72%甲基硫菌磷、25%三唑酮等农药单使用或混合使用，按600倍液喷雾，一般可以达到85%以上的防治效果[9]。杉木赤枯病病原菌主要为拟盘多毛孢属(Pestalotiopsissp.)、黑盘孢目多毛孢属(Pestalotiasp.)、镰刀菌属(Fusariumsp.)。杉木赤枯病病菌以孢子和菌丝体在病叶组织中随枯死针叶落在土中越冬，翌年夏季产生分生孢子借风传播[10]。6—8月中旬发病，7月为发病盛期，此时苗木进入初生长，较嫩弱，因此极易受害。该病蔓延迅速，2 d之内即暴发成灾，发病初期，病原菌首先侵害幼苗顶梢的嫩叶，致使叶尖部出现淡褐色病斑，并很快向下部蔓延，之后迅速扩展到整个顶梢造成顶部枯死，被严重侵害的杉木苗很快出现成片或成块坏死[11]。另有研究表明，在杉木赤枯病的防治中，应用多菌灵或退菌特加尿素(0.5%)加磷酸二氢钾(0.5%)进行交替叶面喷雾，且每隔10 d喷雾1次，连续作业，可有效预防赤枯病的发生[12]。

对南京中山植物园及周边地区的落羽杉属树木叶部的发病情况进行调查发现，该病来势迅猛，由树下到树上、树冠外缘向内膛、复叶基部向顶端发展，多则10 d，少则1周，就可造成2/3叶片变黄，然后脱落。发病时病叶出现褐色小斑点，后扩大变为暗褐色，遇雨潮湿时病斑上产生许多突起的黑色小霉点，症状与水杉和杉木赤枯病症状较类似。然而目前对落羽杉属赤枯病的发生规律及防治方法尚无研究报道。随着落羽杉属树木种植范围的不断扩大[13-14]，赤枯病病害对该属树种的推广应用及经济效益造成了严重影响。因此，探究落羽杉属树木赤枯病的侵染方式和发病规律可为该病的有效防治提供理论指导，而杀菌剂的室内测定可为快速地筛选出安全高效的农药品种及制定有效的防治策略奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料及病症分级标准

选取南京中山植物园苗圃内的落羽杉、墨西哥落羽杉、中山杉118[(落羽杉×墨西哥落羽杉)×墨西哥落羽杉]、中山杉405(墨西哥落羽杉×落羽杉)、中山杉406(墨西哥落羽杉×落羽杉)、中山杉407(墨西哥落羽杉×落羽杉)和中山杉502(墨西哥落羽杉×落羽杉)进行调查研究。调查从4月份落羽杉抽叶后开始，并将落羽杉属树木对赤枯病的发病程度分为5级(代表值分别为1～5)：针叶正常、无发病的为1级；病叶占总叶数的1/4及以下的为2级；病叶占总叶数的 1/4 以上且1/2及以下的为3级；病叶占总叶数的1/2及以上且3/4以下的为4级；病叶占总叶数的3/4及以上的为5级。感病指数=∑(各级株数×代表值)×100%/(总株数×最高级代表级)。

1.2 病原菌越冬方式及传播方式

病原菌越冬方式：在南京中山植物园苗圃采集落羽杉属病树上的芽、枝、梢、病叶和林下表土进行分离培养。统计分离结果，分析病原菌的越冬方式及越冬场所[15]。从落羽杉属树木上采摘新芽、小枝、梢和病叶各60个，将上述材料剪成小块，投入盛有适当蒸馏水的三角瓶中；取树周表土5 g，放入盛有适当蒸馏水的三角瓶中；将上述盛有待测样品的三角瓶置于振荡仪上，充分振荡后，滤去芽、碎片或杂质，制成清洗液；清洗液经离心后，留下5 mL，镜检，每次取0.1 mL，滴在载玻片上，观察有无病原菌的分生孢子存在，重复检查3次[16-17]。孢子传播方式的调查：从发病的落羽杉林内选择6棵标准株，在每个植株东、南、西、北4个方向分别挂上涂有薄薄一层凡士林的玻片来捕捉分生孢子。玻片隔日换回，在显微镜下对每个玻片随机镜检观测5个视野，统计捕捉到的分生孢子数量，记录孢子的飞散日期、孢子的飞散量和天气情况，以确定分生孢子的传播方式[18]。

1.3 落羽杉赤枯病病原菌的杀菌剂筛选

药剂：代森锰锌，有效成分为乙撑-1，2-双二硫代氨基甲酰锰和锌的络盐，70%可湿性粉剂(四川国光农化股份有限公司)；甲基硫菌灵，70%可湿性粉剂(江苏龙灯化学股份有限公司)；多菌灵，50%可湿性粉剂(江苏蓝丰生物化工股份有限公司)；国光黑杀，有效成分为烯唑醇，12.5%可湿性粉剂(四川国光农化股份有限公司)；苯甲丙环唑，有效成分为苯醚甲环唑、丙环唑，30%乳油(青岛瀚生生物科技股份有限公司)；井冈蛇床素，有效成分为井冈霉素、蛇床子素，6%可湿性粉剂(溧阳中南化工有限公司)；波尔多液，80%可湿性粉剂(美国仙农股份有限公司)；福美双，有效成分为12.5%福美甲胂、25.0%福美双、12.5%福美锌，50%可溶性粉剂(天津市兴果农药厂)。室内药效测试：将供试农药用无菌水分别配成4个浓度梯度(6、10、60、300 mg/L)的溶液，分别加入含有相同量的马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，简称PDA)培养基中，每个浓度梯度设置3个重复并且设置空白对照；然后将直径为 0.5 cm 的供试菌落移植于培养基中间，置于25 ℃条件下培养4 d，测量其菌落直径，并计算菌落扩展抑制率。菌丝生长速率测定：在以上室内药效测试的基础上进一步对筛选出的4种农药分别设置9个浓度梯度(50.00、25.00、10.00、5.00、1.00、2.50、0.50、0.10、0.01 mg/L)，进行毒力测定后计算并比较半数有效浓度(effective concentration 50%，简称EC50)[19]。

室内生物测定计算方法与数据处理：采用“十”字交叉法测量菌落直径，菌落扩展相对抑制率=(对照菌落生长净直径-处理菌落生长净直径)×100%/对照菌落生长净直径[20]。初筛后的药剂既用于测定菌落扩展相对抑制率也用于测定浓度对数(X)与抑制菌落生长百分率的机率值(Y)，利用最小二乘法分别求得各杀菌剂对该菌的毒力回归方程Y=a+bX和EC50。然后在初筛药剂的EC50下进行孢子萌发测试并计算孢子萌发抑制百分率。孢子萌发率=萌发的孢子数×100%/总孢子数。孢子萌发抑制率=(对照孢子萌发率-药剂处理孢子萌发率)×100%/对照孢子萌发率。

2 结果与分析

2.1 落羽杉赤枯病的发病规律

2.1.1 病原菌越冬及孢子的释放规律 前期笔者所在实验室通过柯赫氏法则对引起落羽杉属树木赤枯病的病原菌进行了分离鉴定，并利用分子生物学及形态学方法，初步确认致病病原菌为斑污拟盘多毛孢(Pestalotiopsismaculans)。为了确认致病病原菌的越冬方式，从易感病的中山杉405种植土壤中及树木不同部位上分离出病原菌并检查了病原菌菌丝和分生孢子。结果显示，病原菌可在病叶、小枝、梢部和芽中越冬，其中以病叶上的带菌率(96.7%)最高，小枝(76.7%)次之，而梢和芽的带菌率分别为46.7%、31.6%，土壤最低，为0%。因此，认为病叶组织和小枝可能是病原菌的主要越冬场所。此外，对杂交落羽杉405病叶组织和小枝的洗液进行镜检，结果均未发现分生孢子，推测该病原菌不是以孢子而是以菌丝形态越冬。

2.1.2 病原菌的传播方式 从5月初到7月末，每隔1 d记录1次孢子捕捉数量及当天的环境因子(温度、湿度、降水量和风速)。结果表明，病原菌分生孢子5月开始飞散，6月中旬达到飞散最高峰，7月底渐止。经统计发现，孢子飞散与温度的相关系数，即r值最大，为0.617，其次是平均湿度(r值为 0.543)，之后是降水量(r值为0.297)、平均风速(r值为 0.257)。因此，推断孢子飞散的最主要影响因子是温度，其次是湿度、降水量和风速。

2.2 不同落羽杉属树种的抗病性差异

对不同月份落羽杉、墨西哥落羽杉和它们的杂交无性系品种的感病情况进行调查。结果表明，墨西哥落羽杉、中山杉405、中山杉407、中山杉502和中山杉118均为感病品种，而落羽杉、中山杉406为抗病品种。由图1可知，墨西哥落羽杉发病最早，7月开始发病，其次是中山杉407在8月开始发病，中山杉405、中山杉502、中山杉118从9月开始发病。墨西哥落羽杉发病早，且感病较重，感病指数范围为43.7%～96.3%，且感病指数在8—9月期间变化最为明显，因此8—9月为墨西哥落羽杉赤枯病感病最为严重的时期。中山杉405虽发病较迟，9月才开始发病，但病情蔓延较快，感病指数范围为53.3%～96.7%，11—12月，整树枯黄，病叶掉落严重。中山杉407、中山杉502、中山杉118病情较墨西哥落羽杉及中山杉405轻，感病指数范围分别为42.8%～83.1%、41.3%～84.8%、59.6%～86.7%，病势的蔓延较慢。落羽杉、中山杉406不发病。

2.3 落羽杉赤枯病防治技术研究

2.3.1 供试杀菌剂的初筛结果 对比参试的8种杀菌剂对落羽杉赤枯病病原菌的抑制效果。由图2可知，从最大抑制率来看，多菌灵、甲基硫菌磷、蛇床素、苯甲丙环唑、代森锰锌、国光黑杀、福美双、波尔多液对病原菌菌丝的抑制作用依次降低。多菌灵和甲基硫菌磷的最大抑制率达到100%，且多菌灵在各个浓度下对供试菌株的菌落抑制率均达到100%。甲基硫菌磷在较低浓度时对供试菌株的菌落抑制率较低，随着浓度的增加抑制率也随之升高，各浓度间抑制率相差较大，最高达到100%。蛇床素和苯甲丙环唑的最大菌落抑制率也较高，分别达到88.5%、84.6%。蛇床素在较低浓度时已表现出60.3%的抑制率，随着其浓度的增大，抑制率上升到88.5%。苯甲丙环唑与蛇床素相似，但抑制率在同等浓度时均低于蛇床素。代森锰锌、国光黑杀、福美双、波尔多液的最大菌落抑制率依次为52.7%、40.8%、26.8%、5.1%。其中代森锰锌、福美双随着浓度的增加，抑制率相对提高。在一定浓度范围内国光黑杀对菌株的菌落抑制率不与浓度呈正相关关系。其中波尔多液在6、10、60 mg/L时出现了负抑制作用，即在此浓度下波尔多液对斑污拟盘多毛孢的生长有促进作用，只有在浓度为300 mg/L时才对斑污拟盘多毛孢的生长具有抑制作用。结果表明，多菌灵、甲基硫菌磷、蛇床素和苯甲丙环唑的最大菌落抑制率都在80%以上，因此，选取这4种杀菌剂进行下一步试验。

2.3.2 初筛药剂对病原菌菌丝的影响 如图3所示，4种杀菌剂对病原菌菌丝生长的抑制作用均整体随着药剂浓度的增加而增强。多菌灵在浓度为2.50 mg/L时抑制率已达100%，在浓度较低时亦表现抑菌效果。甲基硫菌磷在较高浓度时具有良好的抑制菌丝生长的作用。蛇床素与苯甲丙环唑情况类似，但在较低浓度(0.01～2.50 mg/L)时，在同等浓度下苯甲丙环唑抑制率整体优于蛇床素。此外，分析4种药剂的EC50时发现，甲基硫菌磷的EC50最高，为24.283 mg/L，即它对病原菌株斑污拟盘多毛孢毒力最低；其次为苯甲丙环唑，其EC50为 14.320 mg/L；多菌灵的EC50最低，为1.051 mg/L，说明它对病原菌株的生长抑制作用最强，而蛇床素对斑污拟盘多毛孢的毒力也较高，生长抑制作用较强，其EC50为4.356 mg/L(表1)。

2.3.3 初筛药剂对孢子萌发的影响 表1结果表明，多菌灵、甲基硫菌磷、蛇床素、苯甲丙环唑这4种农药的浓度分别为1.051、24.283、4.356、14.320 mg/L时，对病原菌孢子处理12 h后的孢子萌发抑制率分别为49.4%、53.6%、32.4%、61.8%，其中空白对照的孢子萌发率为86.3%。试验表明，4种药剂不但对斑污拟盘多毛孢菌丝有较高的抑制作用，对孢子萌发也有较好的抑制作用。在各自的EC50条件下，苯甲丙环唑对病原菌孢子萌发的抑制作用最强，其次是甲基硫菌磷和多菌灵，蛇床素对病原菌孢子萌发的抑制作用最弱，抑制率为32.4%。从菌丝生长抑制率和孢子萌发抑制率综合来评定，多菌灵对病原菌的抑制作用最强。

表1 4种杀菌剂对病原菌孢子萌发的影响

3 结论与讨论

落羽杉属树种赤枯病7月下旬开始发病。在1个生长季节中，赤枯病的发生只有1次高峰，时间为8—9月。病原菌主要以菌丝在小枝和落叶组织中越冬，但2种组织中越冬菌的数量差别很大，小枝中较少，落叶病组织中较多。孢子从5月开始飞散，6月中旬捕捉的孢子最多，7月下旬停止，并且温度对其影响较大。因此，在病害暴发前，尤其是高温高湿时要加大对落羽杉属树木赤枯病的防治力度。另外，在不同落羽杉属树种中，墨西哥落羽杉易染病，而落羽杉则较抗病，两者的杂交后代中山杉405易染病、中山杉118和中山杉407次之，中山杉502染病程度轻，而中山杉406则较抗病。本研究发现，落羽杉和墨西哥落羽杉对赤枯病病害的抗性存在较大差异，其杂交子代对赤枯病害的表现也不尽相同，这为今后选育出具有更抗病的中山杉品种奠定了理论基础。

对落羽杉赤枯病致病病原菌的室内杀菌剂进行筛选，得到4种高效杀菌剂：多菌灵、甲基硫菌磷、蛇床素、苯甲丙环唑，它们的EC50分别为1.051、24.283、4.356、14.320 mg/L，对病原菌斑污拟盘多毛孢的孢子萌发抑制率分别为49.4%、53.6%、32.4%、61.8%。多菌灵为内吸性治疗菌剂，长期单一使用易引起病原菌的抗药性，因此须要进行杀菌剂轮换使用或混合使用。由于蛇床素提炼成本较高，单剂使用不经济、难以推广，可以考虑将蛇床素与农用抗生素井冈霉素进行复配使用。多菌灵、甲基硫菌磷[21-22]也可用于土壤处理，且这些药剂在市场上价格适中，容易购买。此外，本研究发现，不同杀菌剂对斑污拟盘多毛孢的菌丝生长及孢子萌发的抑制效果不同，这为进一步在大田中通过优化杀菌剂的配比方案得到更好的抑菌效果奠定了基础。