微乳液胶束电动色谱法分离测定白屈菜中异喹啉类生物碱成分

2018-11-07齐烨迪周鑫悦林诗瑶余丽双

分析科学学报 2018年5期

林舒，齐烨迪，周鑫悦，苏慧，林诗瑶，赖昕，陈莉，余丽双*，2

(1.福建中医药大学药学院，福建福州 350122；2.福州大学食品安全分析与检测教育部重点实验室，福建福州 350116)

白屈菜(Chelidoniiherba)来源于罂粟科植物白屈菜(ChelidoniummajusL.)的干燥全草[1]，其味苦、性凉，有毒，具有抗癌、抗菌、镇静催眠等作用，临床上目前主要用于治疗胃痛、慢性支气管炎、百日咳肠炎等疾病[2 - 5]。白屈菜的主要有效成分是异喹啉类生物碱，并以根部含量最高[6 - 7]。因此，对白屈菜中异喹啉类生物碱进行分析具有重要意义。

目前，白屈菜中异喹啉类生物碱成分的分离检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[8 - 11]和毛细管电泳法(CE)[12 - 15]。其中，HPLC分析时间长，色谱柱容易污染，分析成本较高。CE具有高效、快速、分离模式多、进样体积小、成本低、抗污染能力强等优点,已有多种CE模式被用于分离检测白屈菜中异喹啉类生物碱。例如，Sturm等采用毛细管区带电泳测定白屈菜提取物中原阿片碱、白屈菜碱、黄连碱、血根碱、白屈菜红碱、别隐品碱及刺罂粟碱，并研究其细胞毒性[12]；高小凤等利用微流控芯片毛细管电泳检测白屈菜中的血根碱[14]；Wen等利用非水毛细管电泳分离检测白屈菜中的三种异喹啉类生物碱[15]。但未见采用微乳液胶束电动色谱法(MEEKC)分离检测白屈菜中异喹啉类生物碱的报道。

相比于CE其他分离模式，MEEKC的应用范围更为广泛。本文利用MEEKC分离检测白屈菜中原阿片碱、黄连碱、盐酸小檗碱、白屈菜碱、白屈菜红碱和血根碱6种异喹啉类生物碱成分，并将建立的方法用于白屈菜全草提取液中异喹啉类生物碱的测定，结果令人满意。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Beckman PA800 plus型毛细管电泳仪(美国，Beckman Coulter公司)，配备二极管阵列检测器及32Karat软件；KQ-500DE型数控超声波清洗器；Starter 3C型pH酸度计；HH-4数显恒温水浴锅；XS105电子分析天平；QL-861型涡旋仪。

白屈菜红碱、原阿片碱、盐酸小檗碱购自中国食品药品检定研究院；黄连碱、白屈菜碱、血根碱购自四川维克奇生物制品有限公司。十二烷基硫酸钠(SDS，Amresco)；乙酸乙酯、正丁醇为色谱纯试剂(上海阿拉丁试剂有限公司)；脱氧胆酸钠(SDC，Amresco)；甲醇、乙腈(ACN)为分析纯试剂(国药集团化学试剂有限公司)。所有水均经Milli-Q超纯水系统(Millipore公司)处理。

白屈菜药材，产地东北。

1.2 对照品溶液及样品溶液制备

1.2.1对照品溶液制备分别精密称取原阿片碱、黄连碱、盐酸小檗碱、白屈菜碱、白屈菜红碱、血根碱适量，用甲醇溶解并制成浓度为1.0 mg/mL的对照品储备液。

1.2.2供试品溶液制备取过50目筛的白屈菜药材粉末约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入20 mL HCl-甲醇溶液(0.5∶100)，超声提取30 min，静置放冷过滤，滤渣重复提取两次，合并滤液，水浴蒸干，甲醇复溶并定容至5 mL容量瓶中，使用时取适量加水稀释并混匀，经5 000 r/min离心5 min，取上清液稀释进样。

1.3 电泳工作条件

新毛细管使用前分别用水，0.1 mol/L HCl，水，0.1 mol/L NaOH溶液，水各冲洗20 min；旧毛细管使用前分别用水，0.1 mol/L NaOH溶液，水，运行缓冲液各冲洗5 min。每次进样前，需用分离缓冲溶液冲洗2 min。未涂层毛细管： 60 cm×75 μm(有效长度为49.5 cm)；运行电压：25 kV，检测波长：214 nm和280 nm，压力进样：3.4475 kPa×8 s，操作温度：20 ℃。

2 结果与讨论

2.1 MEEKC分离条件的优化

2.1.1缓冲溶液pH值选择实验考察了不同pH值下分析物的分离效果，见如图1。结果表明随缓冲液pH的增大，6种分析物的分离度逐渐改善；当pH为4.0时，6种分析物的分析时间较短，同时峰形较好。综合考虑分离度和迁移时间的影响，选择缓冲溶液的最佳pH为4.0。

2.1.2表面活性剂及其浓度选择实验中发现单独使用SDS或者SDC均不能使6种分析物分离，而采用SDS+SDC体系的分离效果最好。实验对混合胶束体系中SDS含量的影响进行考察。结果表明，随着SDS含量的增加，分离度增加，当SDS含量达到20 mmol/L时，基本达到基线分离；但超过20 mmol/L时，峰形展宽，迁移时间明显增加。SDS含量选择为20 mmol/L。

固定混合胶束体系中SDS浓度为20 mmol/L，对SDC含量进行优化。由图2可以看出，随着SDC含量增加，6种分析物的分离度增加；当SDC含量达到50 mmol/L时，6种分析物达到基线分离，且电渗流大小适中。因此，选择SDC的浓度为50 mmol/L。

2.1.3正丁醇含量选择实验考察了正丁醇含量3%～11%(V/V)对分离分析的影响。随着正丁醇含量的增加，各分析物间的分离度也随之改变，当正丁醇含量小于8%时，分离度相对较低，当正丁醇含量达到8%时，均达到基线分离。因此，综合考虑分离度、迁移时间等因素的影响，选择正丁醇含量为8%。

2.1.4乙酸乙酯含量选择实验考察了不同油相类型(乙酸乙酯、正辛烷、正庚烷和正己烷)对分离分析的影响。但相较于乙酸乙酯，正辛烷、正庚烷和正己烷更容易挥发，且形成稳定的微乳液所需要表面活性剂的用量较大，因此实验选择以乙酸乙酯作为油相。考察了乙酸乙酯含量在0.3%～1.5%(V/V)之间对迁移行为的影响。随着乙酸乙酯含量的增加，使得各分析物的峰型展宽，且迁移时间增加。因此，最终选定乙酸乙酯为0.3%。

综上所述，用MEEKC法分离白屈菜中6种异喹啉类生物碱对照品的最优条件选定为：20 mmol/L SDS，50 mmol/L SDC，0.3%(V/V)乙酸乙酯，8%(V/V)正丁醇，91.7%(V/V)5 mmol/L Na2B4O7-10 mmol/L H3PO4(pH=4.0)为运行缓冲液，25 kV为分离电压，214 nm和280 nm为检测波长(条件优化时所选取的图谱均为214 nm 波长下的图谱)，进样条件为3.4475 kPa×8 s，柱温20 ℃。

图1 缓冲溶液pH值对6种分析物迁移行为的影响Fig.1 Effect of buffer pH on the migration time of six analytesRunning buffer:5 mmol/L borate-10 mmol/L phosphate buffer(pH=4.0) with 20 mmol/L SDS,40 mmol/L SDC,0.5%(V/V) ethyl acetate,8%(V/V) n-butanol.Separation voltage:25 kV;Detection wavelength:214 nm and 280 nm;Hydrodynamic injection:3.4475 kPa×8 s;pH:a:3.0;b:3.5;c:4.0;d:4.5;e:5.0;f:5.5.Peak identifications:1.Protopine;2.Coptisine;3.Berberinel;4.Chelidoonine;5.Chelerythrine;6.Sanguinarine.

图2 SDC含量对6种分析物迁移行为的影响Fig.2 Effects of SDC content on the migration time of six analytesConcentration:a.10 mmol/L;b.20 mmol/L;c.30 mmol/L;d.40 mmol/L;e.50 mmol/L;f.60 mmol/L;g.70 mmol/L;h.80 mmol/L.The remaining experimental conditions are shown in Fig.1.

2.2 方法学验证

2.2.1线性关系及检测限在最佳实验条件下，对一系列不同浓度的对照品溶液进行分析测定，以各分析物的峰面积(Y)与对应的浓度(X)进行线性回归，并根据三倍信噪比(S/N=3)确定其检测限。所得线性方程，线性范围，检测限如表1所示。6种分析物的峰面积和浓度呈良好的线性关系，检测限可低至0.4 μg/mL。

2.2.2精密度实验取同一浓度的对照品混合溶液，连续进样测定5次，计算峰面积和迁移时间的相对标准偏差(RSD)，从表1中可以看出RSD均在5%范围内，表明方法的精密度良好。

表1 MEEKC法测定6种分析物的线性关系、检测限和精密度

a:the detection wavelength of protopine,chelIdoonine was 214 nm;the detection wavelength of coptisine,berberinel,chelerythrine,sanguinarine was 280 nm.

2.2.3回收率实验为评价该MEEKC法是否可以用于分析白屈菜中提取物样品，实验对白屈菜提取物实际样品进行加标回收率实验。实验结果如表2所示，由于小檗碱、血根碱、白屈菜红碱被杂质干扰不能被定量，因此并未对其进行定量分析。原阿片碱、黄连碱、白屈菜碱的回收率在97.44%～101.02%，符合要求，说明方法较为可靠。

2.3 样品测定

精密称定白屈菜粉末，按1.2.2项下制备供试品溶液，在优化电泳条件下测定白屈菜中6种分析物，电泳图谱如图3所示。通过外标法所测得的含量如表2中所示。

表2 MEEKC法测定白屈菜中生物碱的含量及加标回收率实验结果

图3 白屈菜样品(a)及加标样品(b)的电泳图谱(214 nm)Fig.3 The electropherograms of the extract of Chelidonii herba (a) and the above extract+analytes(b)(214 nm)Peak:1.Protopine;2.Coptisine;3.Berberinel;4.Chelidoonine;5.Chelerythrine;6.Sanguinarine.