快速液相色谱-串联质谱法测定26味中药中黄曲霉毒素

2018-11-07朱筱玲

分析科学学报 2018年5期

朱筱玲*

(江西省分析测试研究所，江西南昌 330029)

黄曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)是黄曲霉(Aspergillus Flavus)、寄生曲霉(Aspergillus Parasiticus)和模式曲霉(Aspergillus Nomius)等在高温高湿时产生的，一组结构中含有一个双氢呋喃环和一个氧杂萘邻酮的剧毒次级代谢产物，对人畜有强烈致癌、致突变和致畸毒性。常见的主要有AFT B1、AFT B2、AFT G1、AFT G2等。其中，AFT B1的三致性最强，在粮食和经济作物中广泛存在，从国际上制定的诸多标准可见其危害性和受重视程度[1]。我国对AFT监测主要集中于食品[2]和饲料[3]，随着对中药需求的增加，国家近年也加强了中药监管。江西属高湿高热地区，中药在生产、加工、贮藏、运输过程中因条件和技术简陋极易霉变污染黄曲霉毒素。中国药典[4]监测AFT的有植物源性14味和动物源性5味共计19味中药，规定AFT B1和4种AFT总量的最高限量分别为5 μg/kg和10 μg/kg，比2010年版中国药典的5味大幅增加。

AFT检测方法有薄层层析法(TLC)、酶联免疫吸附分析法(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)[5 - 12]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[13 - 16]。TLC法操作麻烦、定量差，实际应用少；ELISA法不能测定单个AFT且假阳性率高；HPLC法样品需衍生，操作复杂并对中药易产生假阳性[8]；同位素稀释LC-MS/MS法[5]标准品购买难且价格昂贵。净化柱有用超顺磁纳米免疫磁珠[9]、Oasis HLB固相萃取柱(SPE)[11]和混合型SPE[12]等。以上各柱不具特异性，复杂基质尚需进一步采用免疫亲和柱(IAC)[5]。基于单克隆抗体免疫技术的IAC通过抗原抗体结合特异性地吸附目标物，其他杂质不保留，可实现对复杂基质样品的净化，适合中药中痕量物质快速定量分析。用免疫亲和柱净化-快速液相色谱-串联质谱法对中药中AFT的测定未见报道。该方法灵敏度高、特异性强、污染少，符合当前绿色检验的要求。通过对26味中药800余批次样品的检测未出现一例假阳性，具有实用价值。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

6410B型三重四极杆串联质谱仪(美国，Agilent公司)，配有1200SL快速液相色谱系统，电喷雾离子源(ESI)及Masshunter数据处理软件；Toxin Fast黄曲霉毒素免疫亲和柱(3 mL，北京华安麦科生物技术有限公司)；MecoSep 226真菌毒素多功能净化柱(美国，Romer公司)；T25 DS25型高速均质器(德国，IKA公司)；XH-B型涡旋混合器(江苏康健医疗用品公司)；HC3514型离心机(科大创新公司)。

黄曲霉毒素标准溶液(SUPELCO公司提供，B1、B2、G1、G2：LB46323～6-U；浓度均为3 μg/mL；1 mL装，美国)；甲醇、乙腈、正己烷为色谱纯(美国，Honeywell公司B&J品牌)；NaCl为分析纯。实验用水为市售哇哈哈纯净水。中药样品来自省内各药厂。

1.2 溶液的制备

1.2.1混合标准溶液将黄曲霉毒素标准溶液B1、B2、G1、G2(1 mL)分别用甲醇定容至10 mL容量瓶中，其浓度均为0.3 μg/mL，4 ℃冰箱保存。取适量4种标准储备液用流动相稀释分别配成浓度为1.5、3.0、4.5、6.0 ng/mL的系列混合标准溶液，制作工作曲线。

1.2.2混合基质标准溶液取适量4种标准储备液，用阴性样品提取液稀释，分别配成浓度为0.6、0.9、1.5、1.8、3.0、4.5、6.0、12.0、24.0、30.0 ng/mL的系列混合标准溶液，制作基质校正工作曲线。

1.3 液相色谱与质谱条件

1.3.1色谱条件色谱柱：Luna C18(2)100Å柱(150×2.0 mm i.d.,3μm)；柱温：30 ℃；进样量：1 μL；流动相：甲醇+5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸)(50+50)；流速：0.3 mL/min。

1.3.2质谱条件离子化模式：ESI+；雾化气压力：35 psi；干燥气温度：300 ℃；干燥气流速：10 L/min；毛细管电压：4 000 V；质量扫描范围m/z100～500；质谱扫描方式：多反应监测模式(MRM)检测。检测离子对、源内碎裂电压及碰撞气能量见表1。

表1 黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2的MRM扫描参数

Note：*quantitative product ions.

1.4 样品的提取和净化

称取过2#筛的粉末样品2.5 g(精确至0.0001 g)，置于50 mL的塑料离心管中，加入0.5 g NaCl(如样品脂肪含量高，先用10 mL正己烷分两次涡旋萃取1 min，静置后倒掉上清液)，加入15 mL甲醇+水(70+30)溶液，涡旋1 min后超声1 h。离心5 min(4 000 r/min)，取5 mL上清液，加10 mL水稀释后过玻璃纤维滤纸，滤液全部通过IAC，20 mL水分两次淋洗后抽真空20 s让空气入柱，加1 mL甲醇温育1 min洗脱被测物，流速保持1～3 mL/min。样液经0.22 μm有机相膜过滤后，上机测定。

2 结果与讨论

2.1 线性关系考察

用阴性陈皮基质配制4种黄曲霉毒素溶液，其浓度范围为0.6～30.0 ng/mL，在优化条件下测定，以峰面积(y)对黄曲霉毒素浓度(x，ng/mL)进行线性回归，4种黄曲霉毒素在相应浓度范围内的线性良好,线性相关系数R2均大于0.999，其回归方程和相关系数见表2。

2.2 样品的加标回收率

用陈皮基质标准曲线作对照，在3.0、6.0、12.0 ng/mL 3个浓度水平上进行加标回收实验(6次平均)，黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2回收率在73.8%～100.8%范围(表3)。

2.3 精密度试验

以陈皮基质标准为例，同一标准样品重复9次进样测定，4种黄曲霉毒素的RSD为3.5%～8.2%。

表3 三个浓度添加水平的加标回收率实验结果(n=6)

2.4 前处理过程的优化

2.4.1提取液的筛选黄曲霉毒素溶于甲醇和乙腈，实验比较甲醇+水(70+30)、乙腈+水(84+16)、甲醇和乙腈作介质，前两种的提取效果相当且明显好于后两者，分析是适量的水有利于渗透到基质复杂的中药分子内部而使提取更完全。考虑毒性和成本，选择甲醇+水(70+30)作提取液。

2.4.2提取方法的选择样品中黄曲霉毒素分布很不均匀，按1.4节操作(对无法过筛的样品用高速均质器匀浆)，比对振荡1 h、振荡0.5 h后超声0.5 h、超声1 h，无明显差别，选择超声1 h。

2.4.3净化浓缩方法的选择比较了IAC净化浓缩和直接过MecoSep 226 柱，后者基质干扰严重，导致离子化效率降低使回收率不高，并严重污染分析柱和离子源，故选用前者。

2.5 色谱条件的优化

2.5.1色谱柱的选择比较Eclipse Plus C18柱(50×2.1 mm i.d.,1.8 μm)、Narrow Bore RR柱(100×2.1 mm i.d.,3.5 μm)和Luna C18(2) 100Å柱(150×2.0 mm i.d.,3 μm)，综合考虑采用后者能使4种AFT基线分离、峰形对称、灵敏度高、出峰时间短，等度洗脱5 min全部出峰。

2.5.2流动相的优化质谱电喷雾电离是在溶液状态，流动相的组成和添加物除了影响分析物的保留时间和峰形外，还影响分析物的离子化效率从而降低检测灵敏度[16]。本实验比较了：(a)甲醇+水；(b)甲醇+0.1%甲酸水溶液；(c)甲醇+5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸)三种流动相体系，结果表明(c)的离子化效率最高。进一步对(c)项比较了40+60、45+55和50+50三组，确定用最后一组。

2.5.3基质效应的消除基质效应根据对检测信号影响不同分为基质增强效应和减弱效应[11]。本实验按照1.2节标准溶液制备，以1.5、3.0、4.5、6.0 ng/mL 4个浓度的空白山药和陈皮基质混合标准溶液的响应值除以用流动相稀释混合标准溶液的响应值，结果比值在0.68～0.93之间，显示为减弱效应。实验中对每批次样品严格采用基质标准曲线进行校正，实现准确定量。

图1 黄曲霉毒素标准(A)、桃仁基质校正标准(B)及阳性样品桃仁(C)的总离子流色谱图Fig.1 Total ion current chromatograms of aflatoxin B1,B2,G1 and G2(A),Persicae Semen matrix correction(B) and positive sample Persicae Semen(C)

2.6 实际样品的检测

本方法共检测陈皮、桃仁、酸枣仁、僵蚕、胖大海、柏子仁、莲子、使君子、槟榔、麦芽、肉豆蔻、决明子、远志、薏苡仁、大枣、地龙、蜈蚣、水蛭、全蝎、山药、土鳖虫、虫草菌粉、半夏、山楂、苦杏仁及蜂胶26味中药800余批次，无一例假阳性。还对ELISA法阳性饲料样品进行了确证。黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2的标准和桃仁基质标准及某1批次阳性桃仁样品的总离子流图见图1。此外检出阳性的还有酸枣仁、柏子仁、薏苡仁、槟榔、蜈蚣、土鳖虫等，最高阳性桃仁、槟榔AFT B1和AFT B2检出分别为46.99、47.80 μg/kg和5.24、2.95 μg/kg，两者AFT B1均超出限量近10倍；最高阳性土鳖虫AFT B1和AFT G1检出分别为10.32 μg/kg和20.22 μg/kg。含脂肪高的坚果类(如花生、玉米也属此列)、槟榔及土鳖虫等样品尤其易发霉产生黄曲霉毒素。