光谱法研究G-四链体与盐酸巴马汀的相互作用

李俊芬， 张 琳， 樊 鸽， 李鹏霞， 董 川

(1.山西大学化学化工学院，山西太原 030006；2.山西大学环境科学与工程研究中心，山西太原 030006)

1962年，Gellert[1]课题组证实富G核酸单链中的四个鸟嘌呤残基通过Hoogsteen氢键形成四分体结构，四分体与四分体间利用π-π作用连接便形成G -四链体[2]。根据DNA单链的来源和数目不同，G -四链体可分为分子内G -四链体和分子间G -四链体两种；根据DNA单链的走向和loop连接方式的不同，G -四链体可分为平行G -四链体结构、反平行G -四链体结构和混合G -四链体结构[3]。G -四链体在调控基因的复制与表达、延长端粒序列等方面起着至关重要的作用[4]。研究表明，人类染色体末端富G序列形成的G -四链体可以阻断在肿瘤细胞中高活性表达的端粒酶对端粒DNA引物的识别，从而达到抗肿瘤的目的[5]；c -myc启动子序列中的Pu27形成的G -四链体DNA可以显著抑制肿瘤的生长，原癌基因c -kit、bcl-2、RET等序列也可形成G -四链体结构，调控相关基因的表达[5]。能够稳定G -四链体结构或者诱导富G序列形成G -四链体结构的配体分子已成为近年来开发抗癌药物的热点。

图1 巴马汀的结构式Fig.1 Structure of palmatine

盐酸巴马汀是存在于黄连中的一类生物碱成分，具有高效的生物活性和较好的水溶性，且能够增强白细胞的吞噬能力，具有抗菌杀毒作用[6]，巴马汀的结构式见图1。郝润等[7]发现小檗碱和巴马汀对端粒G -四链体和原癌基因启动子区域G -四链体都有着较好的相对亲和性和选择性，有望成为靶向G -四链体的高效抗癌药物。目前有关盐酸巴马汀与G -四链体相互作用的光谱研究还没有系统报道。

本文通过荧光滴定光谱、紫外滴定光谱、圆二色谱(CD)以及1H NMR谱探究了盐酸巴马汀与G -四链体之间的相互作用。实验发现，盐酸巴马汀和DNA有很强的结合作用，结合作用模式为末端堆积。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-4500型荧光分光光度计(日本，日立公司)；U-2910型紫外-可见分光光度计(日本，日立公司)；MOS 450型多功能圆二色谱仪(法国，Bio-Logic公司)；LX-200型迷你型离心机(7 000 r/min)，AVANCE ⅢHD核磁共振仪(德国，布鲁克公司)；Multiskan GO全波长酶标仪(美国，赛墨飞世尔科技)。

Tris(Biosharp生物科技)；盐酸巴马汀(中国药品生物制品检定所)；ABTS(Sigma)；核酸适配体PS2.M(5′-GTGGGTAGGGCGGGTTGG -3′，上海强耀生物科技有限公司)。实验所用其他试剂均为分析纯，用水为去离子水。

1.2 实验方法

1.2.1溶液的配制盐酸巴马汀用Tris-HCl缓冲液配制成2.5×10-3mol/L储备液。DNA用Tris-HCl缓冲溶液溶解，在90 ℃水浴锅中恒温加热10 min，自然冷却至室温后，放置于冰箱(4 ℃)中，其准确浓度由260 nm处吸光度值计算。以上溶液使用时适当稀释。pH=7.40的Tris-HCl缓冲溶液参照文献方法配制。核磁实验所用的Tris-HCl由90%去离子水和10%氘代水配制而成。H2O2(20 mmol/L)、Hemin(20 mmol/L)及ABTS(20 mmol/L)均用Tris-HCl缓冲液配制。

1.2.2实验方法(1)紫外可见光谱滴定：向1 cm比色皿中加入2.5 mL Tris-HCl缓冲溶液和8 μL盐酸巴马汀储备溶液，Tris-HCl溶液做参比，以微量进样器每次分别向样品和参比液中滴加0.5 μL DNA，搅拌静置30 s后扫描吸收光谱。(2)荧光滴定光谱：固定盐酸巴马汀的浓度为1.25×10-5mol/L，每次滴加0.5 μL DNA，搅拌静置30 s后扫描荧光光谱，直至荧光强度几乎不变(激发和发射狭缝分别为5.0 nm和10.0 nm，激发波长为320 nm)。(3)圆二色谱：移取350 μL Tris-HCl缓冲溶液和2.5 μL G -四链体DNA于1 cm石英比色皿中，每次滴加10 μL盐酸巴马汀进行扫描，直到谱图强度无明显变化。(4)核磁共振谱：将500 μL 1.1×10-3mol/L DNA、150 μL 3.71×10-3mol/L DNA和350 μL 1.73×10-3mol/L盐酸巴马汀的混合液分别加入核磁管中，扫描1H NMR。(5)盐酸巴马汀/G -四链体/Hemin配合物的过氧化酶抑制实验[8]：向96孔板中加入10 μL 20 mmol/L G -四链体DNA，100 μL 20 mmol/L盐酸巴马汀，用缓冲溶液定容至190 μL，室温放置2 h。加入10 μL 20 mmol/L Hemin，搅拌静置1 h，最后加入4 μL 20 mmol/L的2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)溶液，当加入6 μL 20 mmol/L H2O2时，反应开始，用酶标仪检测其在415 nm波长处的吸光度，连续测试35 min并绘制曲线。

2 结果与讨论

2.1 盐酸巴马汀与G -四链体DNA的紫外滴定光谱

配体与G -四链体作用后，其发色团会因与G -四链体DNA的相互作用而产生不同程度的减色(红移)/增色(蓝移)现象。从图2可以看出盐酸巴马汀在波长340 nm和418 nm附近的最大吸收峰的吸光度随着G -四链体DNA的加入不断减弱，减色率分别为39.5%和41.2%，最大吸收波长分别红移了14 nm和18 nm，并且在356、366、450 nm附近出现等吸收点，说明盐酸巴马汀通过π-π堆积作用与G -四链体发生了较强的结合，插入到两个G -四分体平面之间，形成夹心结构或者堆积到了G -四链体末端的G -四分体平面上[9]。

2.2 盐酸巴马汀与G -四链体DNA的荧光滴定光谱

盐酸巴马汀的水溶液荧光较弱，但随着G -四链体DNA的逐渐加入，盐酸巴马汀在波长534 nm附近的荧光强度逐渐增强，如图3所示，再次表明盐酸巴马汀的刚性平面结构与G -四链体发生了π-π堆积作用，其周围环境极性降低，减弱了溶剂对盐酸巴马汀荧光的猝灭作用，从而荧光强度增强。另外，盐酸巴马汀的最大发射峰从530 nm蓝移至522 nm，这可能是由于盐酸巴马汀与G -四链体形成了缔合体，减少了分子碰撞从而减少能量损失[10]。

采用连续等摩尔变化曲线法考察盐酸巴马汀与G -四链体DNA作用的结合位点数[11]，由荧光强度对两者摩尔比作图，如图4所示。由图可见盐酸巴马汀与G -四链体DNA之间是单一的键合模式,结合比为1∶1。此时可遵循Scatchard方程计算结合常数[11 - 12]，曲线见图5。由直线的斜率和截距得到结合常数K=4.83×106L/mol，结合位点n=0.75。说明盐酸巴马汀与G -四链体产生了较强的结合。

图2 G -四链体DNA与盐酸巴马汀的紫外滴定光谱Fig.2 Ultraviolet titration spectra of palmatine chloride with G -quadruplex DNAcpalmatine=1.6×10-5 mol/L，curves from up to down:cDNA=0 - 1.3×10-5 mol/L.

图3 G -四链体DNA与盐酸巴马汀的荧光滴定光谱Fig.3 Fluorescence titration spectra of palmatine chloride with G -quadruplex DNAcpalmatine=1.25×10-5 mol/L，curves from down to up:cDNA=0 - 3.2×10-5 mol/L.

图4 G -四链体DNA与盐酸巴马汀的等摩尔变化曲线Fig.4 Job’s plot of the interaction between G -quadruplex DNA and palmatine chloride obtained by different concentration ratios

图5 G -四链体与盐酸巴马汀作用的Scatchard图Fig.5 Scatchard plot showing the interaction between G -quadruplex DNA and palmatine chloride

2.3 盐酸巴马汀与G -四链体相互作用的圆二色谱研究

圆二色谱(CD)常被用于研究小分子配体与DNA的相互作用或化合物构象的变化规律[13]。图6为盐酸巴马汀与G -四链体相互作用的圆二色滴定曲线。由图可看出，CD谱图在263 nm附近出现正的最大峰值，在242 nm附近出现负的最大峰值，这说明PS2.M在K+的存在下形成了平行的分子内G -四链体结构[14]。加入盐酸巴马汀后，G -四链体位于240 nm处的负吸收峰和263 nm附近正吸收峰强度改变，但峰位置没有显著变化。以上结果表明，盐酸巴马汀与G -四链体DNA形成了复合物，稳定了G -四链体结构，同时G -四链体构象未发生变化。

2.4 盐酸巴马汀与G -四链体DNA相互作用的 1H NMR研究

Watson-Crick碱基对(NH…N)氢键存在时，亚胺质子化学位移在13～14 ppm；而形成G -四链体结构时，鸟嘌呤氢键(NH…O)的化学位移在 10.5～12 ppm范围内[15]。本文利用二维NOE 增强谱(NOESY)，在300 ms,25 ℃条件下研究了G -四链体结构及其与巴马汀的相互作用。亚氨基质子交换缓慢，一般可研究50～300 ms范围的1H NMR图，从而得到更详细的G -四链体结构信息[16]。图7中，G -四链体本身谱图的低场区出现了四个峰，表明四分体的形成；加入盐酸巴马汀后，其中两个峰消失，另外两个峰位置移动，且峰强度减弱，表明巴马汀与G -四链体产生了作用。

图6 盐酸巴马汀与G -四链体DNA的圆二色滴定曲线Fig.6 CD titration curves of palmatine chloride with G -quadruplex DNAcDNA=3.5×10-5 mol/L,a-g:c palmatine =0 - 7.1×10-5 mol/L.

图7 盐酸巴马汀与G -四链体的 1H NMR谱Fig.7 1H NMR spectra of the mixture of palmatine chloride with G -quadruplex DNA"a" is the 1H NMR curve of the interaction between palmatine chloride and G -quadruplex DNA；"b" is the 1H NMR curve of G -quadruplex DNA.

这可能是由于盐酸巴马汀与G -四链体作用后加大了G -四链体亚氨基质子周围的电子云密度，屏蔽效应增强，导致G -四链体峰位向高场移动[17]。由于G -四链体的质子交换一直处于动态变化中，且实验所需的DNA浓度较大，具体结合位点还有待进一步研究。

2.5 过氧化酶抑制实验

利用竞争实验可以探究盐酸巴马汀与G -四链体的结合方式是否为末端堆积。Yang等[18]报道Hemin堆积到G -四链体上后会释放过氧化酶，在H2O2存在时，会对ABTS2-产生氧化作用，其催化氧化产物在415 nm附近有紫外吸收。当G -四链体的其他配体与Hemin具有相同的结合位点时，它将与Hemin竞争结合G -四链体，并减缓G -四链体/Hemin复合物产生过氧化酶的速率，从而降低相应催化氧化产物的吸光度。图8为盐酸巴马汀G -四链体/Hemin配合物的过氧化酶抑制活性曲线，由图可知，在不含盐酸巴马汀的对照组中，G -四链体/Hemin的催化氧化产物在415 nm处的吸光度随时间变化先迅速增强后缓慢下降，加入盐酸巴马汀后，其催化氧化产物吸光度的增加明显受到抑制，说明盐酸巴马汀与Hemin具有相同的结合位点，据此，我们推测盐酸巴马汀与G -四链体的作用模式为末端堆积。盐酸巴马汀与G -四链体的作用及其与Hemin的竞争模拟见图9。

图8 盐酸巴马汀与G -四链体/Hemin配合物的过氧化酶抑制活性Fig.8 Inhibition effect of palmatine chloride on the peroxidase activity of G4 DNA/Hemin complex"a" is the curve of the peroxidase activity of G4 DNA/Hemin complex;"b" is the curve of inhiblition effect of polmatine on the peroriolase activity of G4 DNA/hemin complex.

图9 盐酸巴马汀与G -四链体的作用及其与Hemin的竞争实验模拟图Fig.9 The simulation of the interaction between G -quadruplex and palmatine chloride and competition of palmatine with hemin

3 结论

采用多种光谱手段探究了盐酸巴马汀与G -四链体之间的相互作用。紫外滴定光谱及荧光现象表明盐酸巴马汀通过π-π堆积作用使G -四链体结构达到稳定；根据Scatchard方程计算结合常数K为4.83×106L/mol，结合比n为1∶1；圆二色谱证实在K+存在下，核酸适配体PS2.M形成了平行的G -四链体结构，盐酸巴马汀没有改变G -四链体的构象；1H NMR也表明盐酸巴马汀能够与G -四链体发生相互作用并稳定G -四链体结构。盐酸巴马汀/G -四链体/Hemin配合物的过氧化酶抑制实验表明：两者作用模式为末端堆积。