益气固本胶囊调控哮喘小鼠核因子κB信号通路肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β含量的实验研究

孔一卜， 孙丽平， 刘璐

支气管哮喘(简称哮喘)是呼吸系统常见的由多种炎性细胞、细胞因子及炎症介质等共同参与的气道慢性炎症性疾病。气道重塑是哮喘的主要病理改变，在其发病机制中起着重要的作用[1-3]，与哮喘反复发作密切相关。益气固本胶囊是由国医大师王烈教授验方所研制，临床效果显著，可有效降低哮喘的发病率及复发病情[4-5]。前期相关实验表明，本药物可以调节免疫功能及白细胞介素4(interleukin-4，IL-4)、γ干扰素(interferon-γ，INF-γ)、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)等哮喘病相关因子水平和蛋白表达[6-13]。更深入的研究在于对该病相关信号传导通路中间汇聚点及下游信号调节作用的研究。核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信号通路被认为是哮喘病的关键信号通路，参与哮喘气道重塑的形成。相关研究表明哮喘发作与NF-κB被激活有关，炎症介质肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)是NF-κB被活化过程中重要的刺激因子，其含量对于NF-κB的活性有一定的影响。因此本研究拟观察益气固本胶囊对哮喘模型小鼠血清、肺泡灌洗液中炎症介质TNF-α、IL-1β含量的影响，探讨益气固本胶囊对NF-κB信号传导通路活性的影响及推测其治疗哮喘的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 BALB/c小鼠60只，雌雄不限，体质量18～20 g，由长春生物制品研究所有限责任公司提供[动物合格证号SCXK(吉)-2016-0008]。将60只BALB/c小鼠按随机数字表法分为5组：正常对照组(10只)、模型组(14只)、益气固本胶囊组(12只)、童康片组(12只)、地塞米松片组(12只)。

1.2 试剂与药品 益气固本胶囊(长春中医药大学附属医院，批号：20160301)；童康片(广州康和药业有限公司，批号：160304)；醋酸地塞米松片(天津力生制药股份有限公司，批号：1603014)；卵清白蛋白(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，Sigma分装，纯度>90%，Lot：080M1705V)。

1.3 研究方法 哮喘模型参照文献[8]制备。给药方法：根据临床用量，折算成小鼠的等效计量为益气固本胶囊1.1 g/kg、童康片0.88 g/kg、地塞米松片0.1 mg/kg。将上述药物分别配置成益气固本胶囊55 g/L、童康片44 g/L、地塞米松片0.005 g/L的药液后，按20 mL/kg给予益气固本胶囊组、童康片组、地塞米松组小鼠灌胃。正常对照组、模型组给予等容积的纯净水灌胃。连续给药30 d，致敏期间药物组继续给予上述药物，正常对照组、模型组给予等容积的纯净水。激发方法：参照文献[8]进行激发。每日激发1次，连续10 d，激发前1 h药物组给予受试药，正常对照组、模型组给予等容积的纯净水。

1.4 检测指标

1.4.1 一般情况 观察小鼠在制备哮喘模型及给药期间体表、呼吸频率、体温、体质量的变化。

1.4.2 检测指标 摘小鼠眼球取血3 000 r/min离心10 min，取血清，置于-80 ℃低温冰箱中保存。收取小鼠肺泡灌洗液3 000 r/min离心5 min，取上清液，置于-80 ℃低温冰箱中保存。用酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定血清和肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β的含量。

2 结果

2.1 各组小鼠一般情况比较 制备哮喘模型后小鼠出现耳郭发红，呼吸急促，体温、体质量明显下降，根据体征进行判断，哮喘模型造模成功。经益气固本胶囊、童康片、地塞米松片治疗后，上述症状明显改善。

2.2 各组小鼠血清中TNF-α、IL-1β含量的影响 见表1。

表1 各组小鼠血清中TNF-α、IL-1β含量的影响

注：与正常对照组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.05。

表1结果表明，模型组小鼠血清中TNF-α与正常对照组比较含量升高，差异有统计学意义(P<0.01)。益气固本胶囊组、童康片组、地塞米松组小鼠血清中TNF-α与模型组比较含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。各组小鼠血清中IL-1β含量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 各组小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β含量的影响 见表2。

表2 各组小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β含量的影响

注：与正常对照组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.05，cP<0.01。

表2结果表明，模型组小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β与正常对照组比较含量升高，差异有统计学意义(P<0.01)。益气固本胶囊组、童康片组、地塞米松组小鼠泡灌洗液中TNF-α、IL-1β与模型组比较含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

中医理论认为哮喘的反复发作与体内肺脾肾三脏功能失调而导致的痰饮内伏密切相关。伏痰留于体内，每遇诱因引触，气引痰动，痰气交阻于气道而发为哮喘。明代张景岳在《景岳全书·喘促》中记载：“喘有宿根，遇寒即发，或遇劳即发者，亦名哮喘”；《证因治要》中写道：“哮病之因，痰饮留伏，结成窠臼，潜伏于内。”伏痰既是引起反复发作的内因，又是引起反复发作的宿根。西医学认为气道重塑是长期慢性炎症作用于效应细胞所致，表现为内皮增生、基底膜增厚、平滑肌增生、基质沉积、血管改变等，是哮喘的重要病理改变，也是影响哮喘疗效的重要因素之一。相关研究表明，部分气道重塑的病理改变早在4岁哮喘患儿就可发生。从哮喘的病因及产生机制来看，伏痰宿根与气道重塑均是因长期病理因素导致机体功能失调所致，具有发作期“活化”和缓解期“潜伏”的共同特征[14]。因此，可以推测中医理论的“伏痰宿根”与西医哮喘的“气道重塑”具有一定的相关性，在治疗上均可通过调节肺脾肾三脏功能祛伏痰、除宿根，而达到抑制气道重塑的目的。

益气固本胶囊由黄芪、玉竹、补骨脂、女贞子、太子参、五味子、牡蛎、大枣、佛手、山药、熟地等药物组成，诸药合用达到补肺气以清痰窠，健脾胃以绝痰源，补肾元以充肺根，可以有效的调节肺脾肾三脏功能，祛除宿根，防病反复，达到治疗的目的。由于我们推测伏痰宿根与气道重塑的形成具有一定的相关性，而气道重塑的形成与NF-κB信号通路活性增强有关，因此本实验选取NF-κB信号通路中的炎症介质TNF-α、IL-1β作为研究对象做了相关实验研究。实验结果显示，哮喘小鼠模型血清中TNF-α和肺泡灌洗液中的TNF-α、IL-1β含量均高于正常小鼠，在经益气固本胶囊治疗后呼吸急促等哮喘发作时的症状明显的缓解，且血清中TNF-α和肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β含量降低，说明益气固本胶囊治疗哮喘的作用机制可能和调节TNF-α、IL-1β含量有关。

NF-κB通路被认为是哮喘病中关键信号转导通路。该通路可以通过生长因子、细胞因子、炎性介质、嗜酸性粒细胞趋化因子等作用渗透于气道重塑机制的多个环节和层面，参与气道重塑的过程[15]。NF-κB信号通路活性的增强已经在哮喘性过敏性实验模型和患者中证实。NF-κB是细胞内重要的核转录因子，通常与IκB形成复合体以无活性的方式存在于细胞浆中。TNF-α、IL-1β是对NF-κB活化响应的炎症介质，可以通过刺激气道平滑肌细胞及成纤维细胞，参与气道重塑的形成。当哮喘发作时，细胞受到外界炎症刺激后，使得IκB被磷酸化，NF-κB由抑制状态被激活，诱导炎症介质TNF-α、IL-1β等相关基因的转录，促进炎症介质的合成，增多的炎症介质作为外界刺激，进一步增强NF-κB的活性[16]。

因此我们推测，小鼠在造成哮喘模型后出现TNF-α、IL-1β含量增多及呼吸急促等症状可能与NF-κB信号通路被激活有关，而经益气固本胶囊治疗后TNF-α、IL-1β含量减少且呼吸急促等症状缓解，说明益气固本胶囊可能通过调节哮喘小鼠体内TNF-α、IL-1β含量来抑制NF-κB信号通路活性从而发挥治疗哮喘的作用。益气固本胶囊可以去除宿根伏痰，而宿根伏痰与气道重塑又有一定的相关性，气道重塑的形成与NF-κB信号通路被激活有关，因此我们进一步推测益气固本胶囊治疗哮喘的作用机制也可能和调节NF-κB信号通路活性从而抑制气道重塑有关，其作用机制有待于进一步探讨。