不同时机俞募穴速刺对脑损伤大鼠脑组织白细胞介素6和肿瘤坏死因子α表达的影响

郭素真， 马丙祥， 李瑞星， 李华伟， 陈恬恬， 张晰， 叶玉香

脑性瘫痪(简称脑瘫)是一组持续存在的中枢性运动和姿势发育障碍、活动受限证候群，这种证候群是由于发育中的胎儿或婴幼儿脑部非进行性损伤所致。多伴有感觉、知觉、认知、交流和行为障碍及癫痫、继发性肌肉骨骼问题[1]。脑瘫的病因多与围生期窒息、早产、出生低体质量、感染、病理性黄疸、颅内出血、先兆流产、多胎等因素有关[2]。其中，早产和宫内感染是脑瘫发生的重要因素之一。有研究显示，在低、中等收入国家早产儿的发生率可达15%以上[3-4]，我国的早产儿出生率约为8.1%[5]。李晓捷等[6]研究发现通过对孕鼠腹腔注射脂多糖，可造成早产脑损伤模型仔鼠，从而为研究宫内感染造成脑损伤的机制提供了途径和方法。目前对小儿脑瘫的治疗，我国主要采用中医传统的康复方法和现代的康复技术相结合的方法。针灸作为传统特色疗法在其中发挥了重要的作用。本研究通过观察不同时间点及疗程俞募穴速刺对宫内感染/炎症致早产脑损伤大鼠脑组织中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)和白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)表达的影响，探讨俞募穴速刺对神经元的保护作用及疗效机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级成熟雄性SD大鼠15只，体质量(300±50)g；SPF级成熟雌性SD大鼠30只，体质量(250±50)g，由郑州大学动物实验中心购入，动物合格证号：SCXK(豫)2015-0004。

1.2 主要试剂与仪器 脂多糖(Sigma)；TNF-α抗体(博士德)；IL-6抗体(博奥森)；针灸针(天協牌，0.30 mm×30 mm)。自动包埋机EG1150；石蜡切片机RM2245；摊片机HII220；烘片机HII220；BH-2光学显微镜；徕卡倒置显微镜DMIL；图像分析系统(Image-Pro Plus)。

1.3 造模与分组 参照李晓捷等[6]研究方法建立宫内感染/炎症致早产仔鼠脑室旁白质软化模型。适应性饲养3 d后，于17:00按雌雄比2∶1将大鼠进行合笼。次日上午8时取雌鼠阴道脱落细胞于光学显微镜下观察，以镜下观察到大量丝状精子和落叶状角质细胞记为孕第0天。共检出怀孕大鼠20只，按随机数字表法选取6只孕鼠为生理盐水组，其余14只孕鼠为脂多糖组。在孕鼠孕期的第16、17天连续2 d行腹腔注射，脂多糖组按照350 μg/(kg·d)注射脂多糖，生理盐水组注射等量生理盐水，仔鼠出生后记录孕鼠分娩时间及仔鼠体质量，以胎龄≤21 d的仔鼠记为早产仔鼠。分娩当天取脂多糖组及生理盐水组仔鼠各6只行脑组织病理学检测。确定造模成功后，取早产仔鼠40只按随机数字表法分为早短期针刺组(n=10)、晚短期针刺组(n=10)、长期针刺组(n=10)、模型对照组(n=10)；取正常足月仔鼠为空白对照组(n=10)。

1.4 分组干预 所有仔鼠同等条件喂养，空白对照组及模型对照组每日按针刺组方法固定1次，不针刺。各针刺组取俞募穴，以速刺手法进行干预，每日1次，早短期针刺组从生后第1天开始干预，连续针刺7 d；晚短期针刺组从生后第15天开始干预，连续针刺7 d；长期针刺组从生后第1天开始干预，连续针刺21 d；模型对照组和空白对照组不给予针刺干预，各组大鼠均于21日龄取材检测脑组织IL-6和TNF-α。

俞募穴速刺方法：参照《实验针灸学实验指导》定位[7]，选穴：心俞、脾俞、肾俞、关元、中脘和中极。根据穴位针刺的方向和深度要求采用快速进针、快速出针、不留针的针刺方法。其中心俞、脾俞、肾俞直刺6 mm不留针。关元、中脘、中极直刺2 mm不留针。

1.5 标本制备及实验室检查

1.5.1 标本制备 仔鼠出生即刻，选脂多糖组和生理盐水组孕鼠各2只，取子宫及胎盘放置于10%中性甲醛中固定；选脂多糖组早产鼠和生理盐水组足月产仔鼠各6只，在冰盒上断头取脑组织，冷生理盐水冲洗数次后，取脑组织于耳间线前2 mm水平处行冠状切片，取组织厚度约3 mm，10%中性甲醛固定。仔鼠于21日龄腹腔注射10%的水合氯醛麻醉后，取材及处理方法同上。

1.5.2 病理学检测 取固定好的子宫、胎盘及生后即刻处死的仔鼠脑组织，进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，切片厚度3 μm，60 ℃温箱过夜烤片。常规HE染色，光镜下观察子宫、胎盘情况及脑室旁白质损伤情况。

1.5.3 免疫组织化学检测 取21日龄仔鼠脑组织，进行脱水、透明、梯度浸蜡、包埋、切片、烤片。取组织切片进行脱蜡、水化、3%H2O2室温孵育10 min；5%BSA封闭液室温封闭20 min；孵IL-6一抗或TNF-α一抗(1∶100)，37 ℃恒温60 min；磷酸盐缓冲液4 min×3次；孵二抗37 ℃恒温箱孵育40 min；磷酸盐缓冲液4 min×3次；辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃恒温孵育30 min；磷酸盐缓冲液4 min×3次；DAB室温显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤；苏木素复染2 min，自来水进行冲洗；脱水，透明，中性树脂封固后，高倍显微镜下观察脑组织中IL-6和TNF-α的表达，以细胞浆有棕黄色颗粒沉着为阳性表达，每张切片随机选取5个区域采用美国Image-Pro Plus软件进行光密度值测定，取平均光密度值(mean optical density value，MOD)。

2 结果

2.1 一般情况观察 14只脂多糖组孕鼠中，1只在注射脂多糖次日阴道出血，娩出死亡胎鼠，3只在注射脂多糖后死亡，1只足月分娩，予以剔除，其余9只脂多糖组雌鼠均于孕22 d前分娩。共产出77只早产仔鼠，其中死产仔鼠25只。对照组6只雌鼠全部足月分娩，共产出60只足月产仔鼠，无死产仔鼠。

2.2 新生仔鼠情况 脂多糖组所产仔鼠与对照组出生体质量低，活产仔鼠少。脂多糖组仔鼠出生时皮肤颜色暗红或紫绀，活动少。对照组仔鼠出生时体质量比脂多糖组高、活动比脂多糖组频繁、应激反应比脂多糖组快，皮肤红润。

2.3 病理学观察 子宫及胎盘HE染色示：生理盐水组孕鼠子宫及胎盘组织未见明显炎症反应，未见大量中性粒细胞浸润。脂多糖组孕鼠子宫壁及胎盘可见大量的中性粒细胞浸润，血管充血。

新生仔鼠脑组织病理结果：对照组仔鼠脑组织结构完整，细胞排列均匀整齐，胞核较大。脂多糖组仔鼠脑室旁白质结构稀疏，细胞水肿，神经纤维排列不齐，神经元数目少，可见角质细胞聚集，侧脑室出血改变。

2.4 各组仔鼠脑组织免疫组织化学指标比较 见表1。

表1 各组仔鼠脑组织免疫组织化学指标比较

表1结果表明，各针刺组下调脑组织中IL-6和TNF-α的表达，与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；长期针刺组IL-6和TNF-α表达的下调优于短期针刺组，差异有统计学意义(P<0.05)；早短期针刺组IL-6和TNF-α表达的下调优于晚短期针刺组，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

近年来研究发现，宫内感染/炎症是导致脑瘫发生的高危险因素[8]，宫内感染常伴有脑缺氧缺血，在此过程中促炎症细胞因子可以造成急性脑白质损伤，而因此导致的脑室旁白质软化。脑室旁白质软化是早产儿中最具代表性的脑白质损伤，而炎症反应在早产儿脑室旁白质软化的发病机制中起到重要作用[9]。IL-6、TNF-α是导致脑室旁白质软化发生的两个最常见炎性细胞因子，这些炎性细胞因子通过损伤未成熟的少突胶质细胞或者间接的小胶质细胞活化引起的白质损伤，从而直接影响胎儿大脑发育及神经系统发育[10]。宫内感染时IL-6、TNF-α等炎性因子的升高，与胎儿脑白质损害呈正相关[11]。何柳芳等[12]认为在炎性反应导致脑室旁白质软化发生的过程中，TNF-α是最早释放的促炎症因子，参与了脑损伤炎性反应的整个过程，且研究表明TNF-α增加较IL-1β更早一些。它可刺激小胶质细胞和星形胶质细胞的增殖，增加其他细胞因子的表达及促使活性氧、活性氮的增加，致使少突胶质细胞损伤的发生。早期干预可减轻脑损伤高危儿的神经损伤，降低脑瘫的发生率，故对于脑损伤患儿要早诊断、早干预。

马丙祥等提出“痰”和“瘀”是脑损伤的主要病理因素，进行了相关动物实验，认为一氧化氮合酶、血小板活化因子、TNF-α、IL-6等可能是脑损伤“痰”“瘀”的本质[13-15]。因脑瘫患儿多有早产、宫内发育迟缓、宫内感染等胎儿期疾病史，考虑其存在先天禀赋不足，先天之精不能充养脑髓及五脏六腑、四肢百骸，经脉气血运行无力，正气不足，故易被胎内邪气所侵染，由虚致瘀，痰饮、瘀血生之。而“痰饮、瘀血”等病理产物的留存，损伤脑髓、脏腑的同时，更加重了经络阻滞不通，不能正常输布先天、后天之精气，使患儿日益虚损，形成了恶性循环。基于此，我们提出了“脏腑失调，脑髓失养”是脑瘫发生的重要中医病理机制。如何能在改善脑瘫患儿临床症状的同时，提高患儿体质，使对脑瘫患儿的治疗能够步入日益好转的良性循环，是目前临床亟需解决的问题。在此，我们尝试运用“调节脏腑，充养脑髓”之法，取俞募配穴进行针刺治疗脑瘫患儿，以期能够在一定程度上解决上述问题。

脑瘫中医病位在脑，但与心、肝、脾、肾等脏腑都有密切的联系，俞募穴主要分布于任脉、胃经、肝经、膀胱经。因此，从中医学理论上来说针刺俞募穴具有治疗脑部疾患的作用。心主神明，《素问·灵兰秘典论》谓：“心者，君主之官也，神明出焉”，《本草纲目·辛夷·发明》载“脑为元神之府”，肾主骨生髓，髓通于脑，“诸髓者，皆属于脑”，“脑为心之使”，“肾气上通与脑”，可见脑与心肾关系密切。针刺心肾俞募穴可补肾生髓，开心窍，醒神智，促进脑的发育，提高患儿智力。心开窍于舌，针刺心脏俞募穴不仅可以提高患儿智力，亦可以促进其语言功能的发育，心与小肠相表里，针刺小肠募穴关元具有同样的治疗效果。肾开窍于耳，针刺肾脏的俞募穴可以改善患儿追听差、反应不灵敏的情况，肾与膀胱相表里，针刺膀胱经募穴中极亦可起到相应的治疗效果。故俞募配穴针刺疗法具有应用于脑病治疗的理论基础[16]。通过相关临床研究发现，俞募穴速刺法在促进脑瘫患儿脑发育粗大运动功能、体格生长、减少感染次数和提高智力水平等方面均取得显著疗效[17-18]。

本实验结果表明应用俞募穴速刺法可下调宫内感染/炎症所致早产脑损伤大鼠IL-6和TNF-α的表达，提示俞募穴速刺治疗脑损伤的机制可能是通过调节脑组织炎性因子水平，产生神经保护作用，从而避免或减轻脑室旁白质软化的进展。且研究发现脑损伤早期应用俞募穴速刺对于炎性因子的调节作用优于晚期应用，长疗程应用效果优于短期应用。本实验为俞募穴速刺法的进一步临床推广应用奠定了实验基础，对于治疗宫内感染/炎症所致的早产脑损伤并改善预后具有重要的意义，提倡早期、长疗程应用。在临床的治疗中，俞募穴速刺法充分体现了中医治疗的特色与优势，其不仅可以促进脑损伤患儿的康复，且痛苦小，更容易被患儿及家长接受，值得我们在临床推广应用。