超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法同时测定地表水中28种皮质激素

龚 剑， 林粲源， 熊小萍， 陈迪云， 陈永亨， 吴翠琴

(广州大学环境科学与工程学院，珠江三角洲水质安全与保护省部共建教育部重点实验室，广东省放射性核素污染控制与资源化重点实验室，广东广州510006)

皮质激素通常分为糖皮质激素(glucocorticoids，GCs)和盐皮质激素(mineral ocorticoids，MCs)，是世界范围内应用最广泛的一类类固醇激素，被广泛用于各种炎症和免疫疾病治疗和预防［1，2］。由于具有较高的环境内分泌干扰活性，近年来受到了国际社会的广泛关注。环境中皮质激素的来源主要包括:由人类和动物的排泄进入污水系统，经过污水处理厂不完全处理后排放;或者通过人类农业或畜牧业活动的直接排放［3－5］。进入环境中的皮质激素会导致地表水污染，进而危及生态系统和人类健康［6］。

近年来，针对环境样品中皮质激素的分析方法才逐步发展起来，主要采用选择性好、操作相对简便的液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)［1，7－9］。但目前该类方法覆盖的目标物范围较小，主要集中在氢化可的松、地塞米松、泼尼松等少数几种最常见的糖皮质激素，对盐皮质激素则关注较少［4］。相关研究发现，市政污水中常有较高浓度的糖皮质激素被检出，而天然地表水中的检出率则较低［4，9，10］。考虑到生产生活中使用的皮质激素种类繁多，并且它们在极低的质量浓度水平(ng/L)下就可能对人类和生态环境造成不利影响［6］，因此有必要建立一种高效、灵敏且能同时测定多种糖/盐皮质激素的痕量分析方法，以便对水环境中这类内分泌干扰物进行全面、有效的监控。

本研究采用固相萃取(SPE)富集水样，联合超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱技术，建立了一种同时测定地表水中25种糖皮质激素和3种盐皮质激素的痕量分析方法，并应用于珠江三角洲河流水样的检测。该方法实现了对大部分常见常用的天然和人工合成皮质激素的同时快速检测，具有选择性好、灵敏度高等特点，能够为水环境中皮质激素的监测、行为研究及风险评价提供科学依据和技术支持。

1 实验部分

1．1 仪器、试剂与材料

1260 Infinity-6460 QQQ超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱联用系统(UHPLC-MS/MS，Agilent公司)，配有电喷雾离子(ESI)源，Agilent MassHunter定量分析软件;SPE固相萃取装置(Supelco公司)，Oasis HLB固相萃取柱(500 mg，6 mL，Waters公司)，玻璃纤维滤膜(GF/F，0.7 μm，Whatman公司);甲醇、乙腈、乙酸乙酯(色谱纯，Merck公司)，实验用水均为超纯水(电阻率18.25 MΩ·cm)。28种皮质激素标准品(见表1)均购自Sigma-Aldrich公司，纯度均大于98%。5种同位素标准品:氢化可的松-d4、地塞米松-d4、曲安奈德-13C3、布地奈德-d8、丙酸氟替卡松-d5均购自Toronto Research Chemicals公司，纯度均大于95%。精密称取标准品，用甲醇分别配成质量浓度为10 mg/L的28种目标物的混合标准储备液和10 mg/L的5种同位素替代物混合标准储备液;再将28种目标物的混合储备液逐级稀释成质量浓度范围为1.0～100 μg/L的混合标准溶液，将5种同位素替代物储备液稀释成1 mg/L备用。所有标准溶液均置于－20℃避光储存。

1．2 样品的采集与处理

利用手持式采样泵采集河流表层水(水深0～0.5 m)，置于干净棕色瓶中并加入适量的叠氮化钠(水样中的质量浓度约200 mg/L)，避免微生物降解。样品运回实验室后，立即用玻璃纤维滤膜过滤，收集滤液并置于冰柜4℃避光保存。

样品富集:先后用6 mL乙酸乙酯、6 mL乙腈和12 mL超纯水活化固相萃取柱。向1 L滤液加入适量的同位素替代物，混合标样后以8～10 mL/min的流速过柱。上样完毕后，用10 mL 10%(v/v)乙腈/水溶液淋洗萃取柱，然后真空干燥2 h，除尽柱床中的水分。随后依次用6 mL乙酸乙酯/乙腈(1∶1，v/v)、6 mL乙酸乙酯洗脱，收集、合并洗脱液，用高纯氮气吹至刚干，再用甲醇定容至0.5 mL，过0.22 μm 微孔滤膜，待UHPLC-MS/MS分析。

1．3UHPLC-MS/MS 分析

液相色谱条件:色谱柱为 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C8(100 mm×3.0 mm，1.8 μm);流动相A为0.1%(v/v)乙酸，流动相B为乙腈;流速0.3 mL/min，柱温30℃，进样量3 μL。梯度洗脱程序如表2所示。

表1 28种目标化合物及其多反应监测中的质谱参数Table 1 Twenty-eight target compounds and their mass spectrometric parameters in MRM transition

表1 (续)Table 1 (Continued)

表2 超高效液相色谱梯度洗脱条件Table 2 UHPLC gradient elution program

质谱条件:ESI源，正负离子扫描模式(ESI±)，动态多反应监测(dynamic multiple reaction monitoring，DMRM)模式，雾化器压力为276 kPa(40 psi)，干燥气体流速为11 L/min，离子源温度为300℃，毛细管电压为4 000 V。各物质离子对优化后参数及其保留时间见表1，总离子色谱图见图1。

图1 50 μg/L的28种目标物总离子色谱图Fig．1 Total ion chromatogram of 28 target compounds at 50 μg/L

定量分析:为了有效监控实验过程的系统误差，消减基质效应的影响，提高定量结果的准确性，本研究采用内标法定量。使用5种同位素替代物作为内标对28种目标物进行定量分析，其相互间的对应关系(见表1)为(括号中为目标物编号):氢化可的松-d4(No．1～6)、地塞米松-d4(No．7～12)、曲安奈德-13C3(No．13～18)、布地奈德-d8(No．19～22)、丙酸氟替卡松-d5(No．23～28)。

2 结果与讨论

2．1 固相萃取洗脱液的选择

皮质激素具有中弱极性，使用乙酸乙酯或其混合有机溶剂作为SPE洗脱液常常能得到较好的洗脱效率［4，9，11，12］。考虑到本研究中目标物较多、极性范围较大，除了选取12 mL乙酸乙酯(EtAc)和乙酸乙酯/乙腈(EtAc-ACN)(1∶1，v/v)外，亦将乙酸乙酯/乙腈(1∶1，v/v)+乙酸乙酯(EtAc-ACN+EtAc)(6 mL+6 mL)作为洗脱剂进行比较。结果如图2所示，当使用乙酸乙酯/乙腈+乙酸乙酯洗脱时，28种目标化合物的回收率普遍较高，标准偏差相对较低。

2．2 液相条件的优化

皮质激素类化合物结构相似，因此将其在色谱柱上完全分离存在一定的难度。实验发现，在目标物较多的情况下，采用甲醇体系时各化合物无法完全分离，有共流出现象，信号相互干扰增强［13］。相较而言，使用乙腈作为有机相时，28种目标物的分离效果较好，响应值与使用甲醇时相比，普遍相当或略低。因此最终采用了乙腈/水流动相体系分离分析目标物。此外，比较了甲酸、乙酸这两种常用的离子化添加剂的效果。发现使用乙酸时，目标物的信号强度普遍较使用甲酸时高，故选用0.1%(v/v)的乙酸水溶液作为水相。

图2 洗脱液对回收率的影响Fig．2 Effect of eluting solvent on recoveries

C18反相色谱柱常用于多种类固醇激素的同时测定，目前已报道的方法几乎都采用C18色谱柱［14］。但是，在专门针对数十种且部分含有同分异构体的皮质激素的分离分析时，由于C18柱具有较强的保留性而分离效果不甚理想，尤其是对结构极为相似的差向异构体。例如，无论以甲醇还是乙腈作流动相，在常用的C18反相色谱柱(Agilent Poroshell 120 EC C18，100 mm×4.6 mm，2.7 μm)上，倍他米松和地塞米松两种差向异构体的信号发生重叠，不易分开，难以定性。采用保留性较弱的C8反相色谱柱(Agilent ZORBAX Eclipse Plus C8，100 mm ×3.0 mm，1.8 μm)分离上述差向异构体，取得了良好的分离效果且峰形佳。此外，通过梯度淋洗条件进行了优化，对所有目标物分离效果良好，出峰时间较为合适(见表1)。

2．3 质谱条件的优化

分别在ESI正、负离子扫描模式下对标准样品进行全扫描。结果发现:15种目标物与乙酸的加合物［M+CH3COO］－是丰度最高的离子，选为母离子;13种目标物的质子化分子离子峰响应最高，选［M+H］+作为母离子(见表1)。特征离子对的选取采用ESI±扫描模式，优化碰撞能量和碎裂电压，采用子离子扫描模式，选择响应最高的两个子离子作为特征子离子(见表1)。

为了提高方法的灵敏度，本研究采用DMRM模式，即按照目标物的保留时间设置监测离子的扫描时间窗口，在不同时间段分别进行MRM扫描，以增加窗口期目标离子的扫描频率，进而提高信号响应强度。综合比较发现，设定目标物采集时间窗口(delta retention time)为1.2 min较为合适，与常规MRM扫描结果相比，大部分目标物的响应有了明显提高。

2．4 基质效应的评价

环境样品基质较为复杂，且ESI质谱分析通常会存在基质效应(ME)，影响方法的灵敏度、准确度及重现性。因此本研究采用向萃取浓缩液加标的方法对地表水样进行了基质效应评价。根据公式［14］ME=(1－空白基质溶液中目标物的响应值/纯溶剂中相应目标物的响应值)×100%计算，得到28种皮质激素的ME值(见表3)。结果表明，所有目标物的ME值在2.6%～27.6%之间，主要呈现出基质抑制效应。为了尽可能消除基质效应的影响，本文采用同位素内标法定量。

2．5 方法线性方程和检出限、定量限

在优化的色谱及质谱条件下，将配制好的1.0、2.0、5.0、10、20、50、100 μg/L 混合标准样品溶液按质量浓度从低到高的顺序进行测定，以选定的定量离子峰面积为Y，质量浓度(μg/L)为X绘制标准曲线。分别以3倍和10倍信噪比(S/N)确定方法检出限和定量限。如表3所示，28种目标物在1.0～100 μg/L范围内均具有良好的线性关系(R2＞0.99)，方法检出限和定量限分别在 0.21～0.48 ng/L和0.32～0.72 ng/L之间，满足实验室痕量分析要求。

2．6 加标回收率与精密度

野外空白样品和实验室空白样品中所有目标物均未检出。取1L河水进行基质加标试验，在5、10、50 ng/L 3个加标水平下，所有目标物的平均回收率(n=5)为68.8%～108.7%，相对标准偏差低于10%(见表4)。本方法的准确度与精密度能满足环境监测中痕量有机污染物的分析要求。

表3 目标化合物的线性方程、相关系数、检出限、定量限及基质效应Table 3 Linear equations，correlation coefficients，limits of detection(LODs)，limits of quantification(LOQs)，and matrix effects(MEs)of the target compounds

表4 地表水中28种皮质激素的加标回收率及精密度(n=5)Table 4 Spiked recoveries and precisions of the 28 corticosteroids in surface water(n=5)

表4 (续)Table 4 (Continued)

2．7 实际样品分析

应用本方法测定了4份取自珠江三角洲河流的表层水样，28种皮质激素的检测结果见表5。珠江广州段和东江的皮质激素检出率较高，分别有9种目标物被检出;西江和北江的检出率则较低，分别有5种目标物被检出。

28种目标物中，盐皮质激素:醛固酮、螺旋内酯、醋酸脱氧皮质酮的含量在ND～3.09 ng/L之间(ND表示未检出);糖皮质激素:氢化可的松、甲基泼尼松龙、地塞米松、皮质酮、氟米松、氟尼缩松、曲安奈德、布地奈德、安西奈德、丙酸氯倍他索、糠酸莫米他松、丙酸氟替卡松二丙酸倍氯米松的含量在ND～5.91 ng/L之间。其中检出率较高的6种皮质激素的MRM色谱图如图3所示。

表5 珠江三角洲河流表层水中的皮质激素含量Table 5 Contents of corticosteroids in the surface water from the rivers of Pearl River Delta

图3 实际水样中6种皮质激素的多反应监测色谱图Fig．3 MRM chromatograms of the six corticosteroids detected in real water samples

3 结论

利用SPE富集净化技术并联合ESI±动态多反应监测扫描方法，建立了一种UHPLC-MS/MS同时测定地表水中28种皮质激素的痕量分析方法，实现了对大部分常见常用的盐/糖皮质激素的同时快速检测。该方法具有选择性好，灵敏度、精密度和回收率高等特点，可广泛应用于环境中皮质激素的监测、行为研究及风险评价等领域。