聚乙二醇二甲基丙烯酸酯整体柱固相萃取-高效液相色谱法测定血清中卡马西平和10-羟基卡马西平

2018-11-06陈雪蕾张倩影安壮壮王曼曼徐厚君

色谱 2018年11期

李娜，陈雪蕾，张磊，张倩影，安壮壮，孙鑫，王曼曼*，徐厚君*

(1．华北理工大学公共卫生学院，河北唐山063210;2．华北理工大学附属医院，河北唐山063000)

癫痫是一种由多种原因引起脑部神经元突发性异常放电的慢性疾病，是神经系统疾病中仅次于脑血管疾病的第二大顽症［1］。癫痫需长期维持治疗，但抗癫痫药物有效血药浓度范围较窄，个体差异较大，较易发生药物毒害事件［2］，因此，临床上需要进行血药浓度的监测以实现个体化给药并避免用药恶性循环。卡马西平(carbamazepine，CBZ)和奥卡西平是常见的抗癫痫药物，前者以原型代谢，而后者在体内降解为有药理活性的10-羟基卡马西平(10-hydroxy carbamazepine，MHD)，因此，临床上通过监测CBZ和MHD的浓度对这两种抗癫痫药物进行量效评价［3］，其有效血药浓度分别为 4～12 μg/mL和 15～35 μg/mL［4］。CBZ 和 MHD 的结构式见图 1。

图1 卡马西平和10-羟基卡马西平的结构式Fig．1 Chemical structures of carbamazepine(CBZ)and 10-hydroxy carbamazepine(MHD)

抗癫痫药物血药浓度的分析包括样品前处理和仪器测定两个环节，其中仪器测定主要利用色谱法［5－7］。有研究［8］表明，在色谱分析中，样品前处理所消耗的时间最多，也是误差的主要来源。因此，发展高效、简易的样品前处理方法具有重要意义。目前，血液样品中CBZ和MHD的前处理方法主要有蛋白沉淀法(protein precipitation)、液液萃取法(liquid-liquid extraction，LLE)和基于 C18、亲水-亲脂平衡柱(hydrophilic-lipophilic balance sorbent，HLB)的固相萃取法(solid-phaseextraction，SPE)［9－12］。

有机聚合物整体柱材料作为一种常用的固相萃取吸附剂，目前已成功用于食品、药品和环境等领域的前处理中［13－15］，它是由单体、交联剂等混合物通过原位聚合制备而成的棒状整体［16］。与传统的填充型萃取柱相比，有机聚合物整体柱材料具有结构连续多孔、通透性好、柱压低、传质快等优点。聚合物整体柱通常由单体提供可作用的功能基团，交联剂提供骨架结构，二者共聚得到聚合物整体柱［17］。本实验仅使用乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)，在注射器柱管中构筑了一种聚EDMA整体柱，用于血清样品中CBZ和MHD的富集、净化，并结合高效液相色谱法，建立了简单、高效的检测癫痫患者血清中抗癫痫药物的分析方法。

1 实验部分

1．1 仪器和试剂

Agilent 1260型高效液相色谱仪-二极管阵列检测器(HPLC-DAD，美国Agilent公司);JEM-2800F聚焦离子束-电子束双束电镜(美国FEI仪器有限公司);ET-3301A氮吹浓缩仪(上海欧陆科仪有限公司);娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

ProElut C18固相萃取柱(2 mL，北京迪马欧泰科技发展公司);一次性无菌注射器(2 mL，山东威高集团医用高分子有限公司)。EDMA(纯度98%)和乙酸乙酯(ethyl acetate，色谱纯)(上海阿拉丁试剂公司);甲醇(MeOH)和乙腈(ACN)(色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific公司);N，N-二甲基甲酰胺、聚乙二醇400、1，4-丁二醇和偶氮二异丁腈、丙酮、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、乙酸铵(CH3COONH4)纯度均＞99%，均购自国内公司。

CBZ(纯度99.7%，中国食品药品检定研究院);MHD(纯度98%，北京迪马欧泰科技发展公司)。用MeOH配制质量浓度为 100 μg/mL的 CBZ和MHD标准储备液，分别于4℃和－20℃下保存。

1．2 聚EDMA整体柱的制备

准确量取 650 μL EDMA，移至含有 1 700 μL N，N-二甲基甲酰胺、755 μL 1，4-丁二醇和 220 μL聚乙二醇400的混合溶液中，再加入10 mg偶氮二异丁腈，于室温下超声混合均匀。取500 μL混匀后的溶液灌入2 mL注射器空柱管中，两端密封，于65℃水浴反应25 h。反应完成后，用MeOH冲洗该柱，得到聚EDMA整体柱，待用。

1．3 血清样品的采集和制备

采集河北省某医院服用卡马西平或奥卡西平癫痫病患者血液样品各4例，在患者维持服药剂量达到稳态(通常连续服药时间≥2～3周)后，于晨起服药前采集肘静脉血4.0 mL，静置 30 min后，以3 000 r/min离心10 min，取上清液，经0.45 μm 微孔滤膜过滤，待测。健康志愿者血液样品作为空白对照样品，采集和处理方法同上。本实验经华北理工大学医学伦理委员会批准。

1．4 固相萃取血清中CBZ和MHD

使用ACN和纯水各1 mL对聚EDMA整体柱平衡，上样稀释后的血清样品2 mL(加入等体积的纯水稀释)，加压使样品以1 mL/min的流速流出，然后使用2 mL CH3COONH4淋洗以除去吸附在固相萃取柱上的杂质。最后，使用2 mL MeOH对CBZ和MHD进行洗脱，收集流出液，于25℃、48 kPa条件下氮吹浓缩，用MeOH定容至0.2 mL，待测。

1．5 色谱分离条件

色谱柱为Agilent EC-C18柱(150 mm×4.6 mm，4 μm，美国Agilent公司);柱温为25℃;流动相为(A)纯水和(B)MeOH;流速为1 mL/min。梯度洗脱程序为 0～4.0 min，50%B;4.0～8.0 min，50%B～55%B。进样量为10 μL;检测波长为220 nm。

2 结果与讨论

有机聚合物整体柱通常是由单体、交联剂、致孔剂以及引发剂原位聚合而成。传统的整体柱，采用单体提供功能基团，交联剂提供骨架，本研究仅使用EDMA构筑固相萃取吸附剂，以期得到一种制备简单、吸附性能良好的吸附剂材料。

CBZ和MHD是弱极性化合物，常用C18、HLB固相萃取柱进行前处理，而聚EDMA整体柱表面具有典型的弱极性基团［17］，因此可用于血液中CBZ和MHD的富集和净化。

2．1 聚EDMA整体柱的表征

图2为聚EDMA整体柱横截面扫描电子显微镜图，可以看出，聚EDMA整体柱孔结构均匀，通透性良好，适宜作为固相萃取吸附剂。

图2 聚EDMA整体柱扫描电子显微镜图(放大倍数5000)Fig．2 Scanning electron microscopy image of poly EDMA monolithic column(magnification of 5000)EDMA:ethylene glycol dimethacrylate．

2．2 聚EDMA整体柱制备条件的优化

在聚合物整体柱的制备过程中，聚合度受聚合时间和温度的影响，聚合度过大会导致整体柱表面裸露的颗粒变少、孔径变小以及比表面积减小，导致压力增高［17］，从而影响整体柱的萃取性能。因此实验考察了反应时间(20、25和30 h)和反应温度(60、65和70℃)对整体柱萃取性能的影响。

实验固定反应温度为65℃，考察反应时间为20、25和30 h时，聚EDMA整体柱对CBZ和MHD萃取性能的影响(见图3a)。当反应时间由20 h增加至25 h时，萃取效率随聚合时间的延长而增加，继续增加反应时间至30 h，其萃取效率降低。

固定反应时间为25 h，比较反应温度(60、65和70℃)对整体柱萃取效率的影响(见图3b)。当反应温度为65℃时，整体柱对两种目标物的萃取性能最佳。因此本实验选择反应温度65℃、反应时间25 h的制备条件。

2．3 聚EDMA整体柱固相萃取条件的优化

固相萃取的淋洗和洗脱环节决定了方法的准确度，因此实验考察了淋洗溶液种类、洗脱溶液种类和体积对目标物萃取效率的影响。

2．3．1 淋洗溶液种类

淋洗步骤是最大限度地淋洗杂质而仍将目标物保留在固相萃取柱上的步骤。由于血液样品的主要杂质为蛋白质和脂肪，同时考虑到聚EDMA整体柱与待测物的弱极性作用，实验考察了不同淋洗溶液(25 mmol/L NaH2PO4、25 mmol/L CH3COONH4和MeOH-H2O(2∶8，v/v))对目标物萃取效率的影响(见图4a)。实验对2 mL含2 μg/mL CBZ和4 μg/mL MHD的加标血清样品进行固相萃取。结果表明，当25 mmol/L CH3COONH4作为淋洗溶液时，淋洗效果较好，CBZ和MHD的回收率最佳。

2．3．2 洗脱溶液的种类和体积

综合考虑洗脱溶液的极性、毒性及目标物的溶解度等因素的影响，对2 mL含2 μg/mL CBZ和4 μg/mL MHD的加标血清样品进行固相萃取，考察MeOH、ACN、丙酮和乙酸乙酯4种洗脱溶液对CBZ和MHD的洗脱效果(见图4b)。结果表明，MeOH的洗脱效果最佳。为了节约溶剂，同时避免洗脱溶液过多而引起的误差，实验考察了不同洗脱体积(1、2和3 mL)对萃取效率的影响(见图4c)。结果表明，当洗脱体积从1 mL增加至2 mL时，洗脱效率增加;继续增加至3 mL时，目标物回收率降低，同时氮吹处理的时间延长。因此实验最终选择2 mL MeOH进行洗脱。

图4 (a)淋洗溶液种类、(b)洗脱溶液种类和(c)洗脱溶液体积对CBZ和MHD回收率的影响(n=3)Fig．4 Effects of(a)type of washing solvent，(b)type of elution solution and(c)elution volume on the recoveries of CBZ and MHD(n=3)

2．4 聚EDMA整体柱的富集净化效果

在最优条件下，对加标 2 μg/mL CBZ和 4 μg/mL MHD的健康人血清样品直接进样，和经聚EDMA整体柱固相萃取以及商品化C18固相萃取柱萃取后进行分析和对比(见图5)。结果表明，直接进样，CBZ和MHD色谱峰响应较低，且杂质峰明显(见图5a);经聚EDMA整体柱固相萃取后，CBZ和MHD得到明显富集，且杂质峰的干扰显著降低(见图5b)，并与商品化C18固相萃取柱的富集、净化效果相当(见图5c)。

2．5 方法验证

2．5．1 线性范围、检出限与定量限

对 0.02～40 μg/mL CBZ 和 0.05～100 μg/mL MHD标准溶液进行测定(n=3)，以质量浓度(x，μg/mL)为横坐标、峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线。如表1所示，CBZ和MHD在各自的范围内线性关系良好，相关系数(r)均为0.999。

对加标空白血清样品进行分析，以3倍和10倍信噪比(S/N)确定CBZ和MHD的检出限(LOD)和定量限(LOQ)，结果表明，CBZ和MHD的LOD分别为0.004 μg/mL 和0.01 μg/mL，LOQ 分别为0.014 μg/mL 和 0.04 μg/mL。

2．5．2 回收率和精密度

对空白血清样品进行3个水平的加标回收试验，每个加标水平平行测定3次。结果表明，CBZ和MHD的平均回收率为92.7%和94.2%，日内精密度和日间精密度分别为1.3%～3.2%和1.5%～6.1%。说明该方法准确度和精密度均较高，满足分析要求。

2．5．3 聚EDMA整体柱的重复性和稳定性

采用相同批次(n=3)和不同批次(n=5)制备的聚 EDMA整体柱对加标 2 μg/mL CBZ和 4 μg/mL MHD的健康人血清样品进行固相萃取，以CBZ和MHD的色谱峰面积计算相同批次和不同批次的RSD，分别为1.8%～4.1%和2.9%～5.3%。同一固相萃取柱重复使用8次，CBZ和MHD色谱峰面积的RSD≤5.8%。上述结果表明该整体柱具有良好的重复性和稳定性。

图5 加标空白血清样品经(a)直接进样、(b)聚EDMA整体柱和(c)商品化C18固相萃取柱萃取后的色谱图Fig．5 Chromatograms of blank serum samples with(a)direct injection，and solid phase extraction by(b)the poly EDMA monolithic column and(c)the commercial C18column The samples were spiked with 2 μg/mL CBZ and 4 μg/mL MHD．

表1 CBZ和MHD的线性范围、回归方程、相关系数、检出限、定量限、回收率及其相对标准偏差Table 1 Linear ranges，regression equations，correlation coefficients(r)，limits of detection(LODs)，limits of quantification(LOQs)，recoveries and their relative standard deviations(RSDs)of CBZ and MHD

2．6 实际样品分析

为进一步验证方法的可行性，使用聚EDMA整体柱，结合高效液相色谱法测定服用CBZ和奥卡西平的癫痫患者的血清样品各4例，结果见表2。在4例服用卡马西平的癫痫患者的血清样品中均检测出CBZ，含量为 0.38±0.02～10.02±0.01 μg/mL;在 4例服用奥卡西平的癫痫患者血清样品中均检测出MHD，含量为 0.67±0.01～19.43±0.04 μg/mL。为进一步说明结果的准确性，对8份癫痫患者血清样品进行加标回收试验，平均加标回收率为85.7%～95.2%，表明结果准确，具有可信度。