右美托咪定预处理对肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤的抗炎作用

杨春梅 于明懂 王玉波高春霖

(1.天津市环湖医院，天津 300060； 2.天津医科大学第二医院，天津 300211)

重型颅脑创伤、胸腹主动脉瘤手术、休克等均可诱发肾脏缺血再灌注损伤，进而导致急性肾衰竭，严重威胁患者生命[1]。肾缺血再灌注损伤是一个复杂的病理生理过程，其中炎症反应在肾缺血再灌注损伤中起着重要作用。肾小管上皮细胞对缺血缺氧、中毒、脓毒血症等损伤因素非常敏感，是肾缺血再灌注时最易受到损害因素攻击的靶细胞，也是肾组织炎症介质的主要来源[2]。实验研究[3]表明，右美托咪定可减轻肾缺血再灌注损伤，本研究拟重点从免疫因子的变化初步探讨右美托咪定预处理对缺氧/复氧诱导下人肾小管上皮细胞的保护作用，为肾缺血再灌注损伤的保护提供新策略。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人肾小管上皮细胞系HK-2(ATCC公司)复苏后培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基(GIBCO，美国)，置于37 ℃、5%CO2培养箱中贴壁培养。待细胞80%融合时，用0.05%胰蛋白酶(GIBCO公司)消化传代培养。

1.2 实验分组

采用随机数字表法分为4组(n=24)：正常对照组(CON组)、右美托咪定组(DEX组)、缺氧复氧组(H/R组)、缺氧复氧+右美托咪定组(H/R+DEX组)。DEX组和H/R+DEX组加入0.1 nmol/L的右美托咪定(批号：09081232，江苏恒瑞医药股份有限公司)孵育2h，随后CON组和DEX组细胞置于37℃含(5%CO2-21%O2-74%N2)常氧恒温细胞培养箱28 h，H/R组和H/R+DEX组细胞置于37 ℃含(5%CO2-1%O2-94%N2)的厌氧培养罐中缺氧培养24 h后，取出置于37℃含(5%C02-21%02-74%N2)常氧恒温细胞培养箱进行复氧培养4 h。

1.3 形态学观察

倒置显微镜下直接观察各组细胞生长状况并拍照。

1.4 MTT法测定细胞活力

取对数生长期的HK-2稀释成细胞悬液，以含10%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度为1.5×104/ml接种于96孔培养板，200 μl/孔，孵育24 h后，每组取6孔，每组给予相应处理后，随后加入MTT溶液100 μl/孔，37 ℃避光孵育4 h后，小心弃上清液，加入DMSO 150 μl/孔，振荡混匀10 min，采用ST-360酶标仪(上海科华实验系统有限公司)，在570 nm波长处测定各孔的吸光度值(OD值)，以此反映细胞活力，实验重复3次。

1.5 酶联免疫吸附检测

按照 ELISA试剂盒说明，检测培养细胞的上清液TNF-α、IL-1β、IL-10的浓度，通过酶标仪( MK3 LAB芬兰)检测 450 nm的吸光度，所有吸光度结果通过标准曲线标准化，计算出样品水平。实验重复3次。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1倒置显微镜下，CON组和DEX组细胞贴壁良好，形态正常，H/R组活细胞数减少，悬浮细胞增多，呈水泡样变性，H/R+DEX组细胞状态较H/R状态明显改善。见图1。

图1 倒置显微镜下各组细胞生长状态

2.2与CON组相比，H/R组和H/R+DEX组细胞活力明显降低(P<0.05)；与H/R组相比，H/R+DEX组细胞活力明显升高，见表1。

表1 四组细胞活力的比较

注：与CON组比较，aP<0.05;与H/R组比较，bP<0.05。

2.3与CON组相比，H/R组和H/R+DEX组细胞TNF-α、IL-1β浓度明显升高、IL-10浓度明显降低(P<0.05)；与H/R组相比，H/R+DEX组细胞TNF-α、IL-1β浓度明显降低，IL-10浓度明显升高(P<0.05)。见表2。

表2 四组细胞TNF-α、IL-1β及IL-10浓度的比较

注：与CON组比较，aP<0.05；与H/R组比较，bP<0.05。

3 讨 论

预实验结果表明0.1 nmol/L右美托咪定预处理2 h减轻缺氧复氧细胞损伤的效应最为明显，因此选择右美托咪定浓度0.1 nmol/L，预先给药时间为2 h。本研究结果表明与H/R组比较H/R+DEX组细胞状态改善，细胞活力升高，提示缺氧复氧条件下，右美托咪定预处理可减轻HK-2细胞的损伤。在缺血、缺氧等各种应激条件下，毛细血管内皮细胞损伤，白细胞聚集、黏附、激活血小板，释放大量的炎症介质，直接介导了肾脏间质内的巨噬细胞的微环境发生改变，而活化的白细胞在微血管内聚集，又释放大量的炎性介质，吸引更多的中性粒细胞聚集、浸润，加重炎症反应，造成恶性循环[4]。促炎和抗炎是一个相互作用的过程，且炎症反应发生后即出现抗炎症反应，TNF-α、IL-1β是两个重要的炎症细胞因子。在缺血再灌注期间，TNF-α、IL-1β释放增加，而IL-1β是炎症反应早期阶段产生的多潜能细胞因子，它可以诱导 TNFα、IL-6和 IL-8等细胞因子的产生，在急性肾缺血再灌注损伤中发挥重要作用[5-6]，是引起肾小管上皮细胞炎性损伤和凋亡的关键效应分子。IL-10是重要的负免疫调节因子，可抑制炎症因子和趋化因子的释放，从而抑制缺血后炎症反应和免疫损伤，减少肾缺血后的细胞坏死[7]。DEX预处理可通过激动α2受体而达到抑制交感兴奋、免疫调节、抗感染等作用，并通过这些途径实现对各重要器官的保护作用[8]。本实验中，与CON组相比，H/R组和H/R+DEX组细胞状态转坏，细胞活性和IL-10浓度下降，TNF-α、IL-1β浓度升高；而与H/R组相比，H/R+DEX组细胞活性和IL-10浓度升高，TNF-α、IL-1β浓度降低；提示右美托咪定预处理可通过抑制缺氧复氧引起的炎症反应，减轻肾小管上皮细胞损伤，但其具体机制有待进一步探讨。

综上所述，右美托咪定预处理可以抑制缺氧复氧引起的肾小管上皮细胞的损伤，并减轻其炎症反应。