RM6240型系统在记录诱发场突触后电位中的应用

， ，

(山东师范大学 生命科学学院, 山东 济南 250014)

神经系统信息传递的基本形式是电信号，突触后电位就是其中的一种。大量排列整齐的神经纤维形成的突触后电位，整合为场突触后电位。场突触后电位能够很好地衡量突触传递强度，是评价突触传递效能的重要指标，也为研究突触可塑性的分子机制提供了有效手段。20世纪50年代，研究者就开始应用电刺激方法在海马复合体中记录诱发突触后场电位，从而为研究海马依赖的学习记忆的分子机制开辟了新途径[1]。随后，研究者将诱发场突触后电位记录技术运用到有纤维连接的不同脑区，如内侧前额叶和伏隔核2个脑区。组织解剖学研究表明,内侧前额叶有大量谷氨酸能神经纤维投射至伏隔核，这些神经投射纤维在伏隔核背部(侧脑室底端)相对集中且排列整齐，因此通过电刺激内侧前额叶，可以在伏隔核诱发场突触后电位[2-4]。由于该通路在目标导向行为以及动机行为中扮演重要角色，因此，研究该通路所发生的神经适应性改变对揭示目标导向或动机行为内在神经机制具有重要价值[5-7]。

RM6240生物信号记录系统是集放大器、滤波器、模数(A/D)转换以及刺激隔离器一体的电信号记录分析系统。该系统采样频率最高可达400 kHz，通常记录场电位所采用的采样频率为1～2 kHz。同时，该系统的低通滤波截止频率可高达10 kHz，而高通滤波频率可以为直流(0 Hz)或截止频率低达0.016 Hz；电位响应灵敏度最大为2 μV/div。此外，刺激隔离器可以产生各种单脉冲、双脉冲以及连续单脉冲刺激，且可以在电流或电压模式切换，刺激选择比较灵活。由此可见，RM6240型系统具备开展诱发场电位实验的条件。

尽管RM6240型生物信号记录系统被广泛用于大学生理学教学实验中，但是大部分院校并没有面向学生开展诱发场电位实验，其主要原因是基于该系统的诱发场电位实验操作平台未被搭建。本文中应用RM6240型系统，并结合自制电极，尝试记录内侧前额叶-伏隔核通路中诱发场突触后电位；同时，探索合适的方法以完善实验数据分析，为学生开展相关实验提供相应的参考。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

主要试剂包括：镍铬合金丝，美国California Fine Wire公司；水合氯醛，天津科密欧化学试剂有限公司；异氟烷，深圳瑞沃德生命科技有限公司；尼氏染色液，上海碧云天生物技术有限公司。

主要仪器包括：RM6240C型系统和SWF-1D型微电极放大器，成都仪器厂；Cryostar NX 50型冰冻切片机，美国Thermo Fisher Scientific公司；SMZ745T型解剖镜成像系统， 日本Nikon公司； MATLAB软件， 美国MathWorks公司； pClamp10软件， 美国Molecular Devices公司。

1.2 实验动物

健康成年雄性Wistar大鼠， 体质量为250～310 g，购于山东大学实验动物中心，许可证SCXK(鲁2013-0009)。动物饲养于恒定温度为(23±1)℃及相对湿度为50%～60%的饲养房中，可以自由取食和饮水。动物在饲养房中适应1周后，开始被用于实验。

1.3 电极

电极材质为特氟龙包被的镍铬合金丝，直径为100 μm。首先，剪裁适当长度的合金丝(长度取决于目标脑区)若干，将合金丝一端特氟龙包被层剥离(长度约为2 mm)，焊接于排母座上，将2股合金丝均匀地缠绕在一起。然后，修剪(倾斜45°)以保证2股合金丝尖端有一定高度差(0.5～1 mm)。最后，基座和合金丝连接处用绝缘胶密封，以保证电极阻抗为0.5～0.8 MΩ，放置备用。

1.4 诱发场电位记录及数据分析

本研究中采用脑立体定位仪以精确定位内侧前额叶和伏隔核。内侧前额叶属于皮质，位于颅骨下浅层，定位相对容易，但是伏隔核属于皮质下深部核团，定位较难。另外，2个脑区解剖位置较近，前后相差约2.2 mm，因此，本实验中对伏隔核定位的操作臂向尾部方向倾斜10°，以便对内侧前额叶定位的操作臂进行操作。

称取大鼠体质量，按照400 mg/kg的剂量，向其腹腔注射质量分数为4%的水合氯醛进行诱导麻醉(仅用于手术)。待大鼠呼吸均匀平缓，且对后肢疼痛刺激无收缩反射后，将其固定于立体定位仪上，调整两侧耳杆使大鼠头部正中线位于齿杆中央，固定耳杆和齿杆，确保大鼠颅骨平面水平。去除皮下结缔组织以暴露颅骨，用少量体积分数为2%的双氧水清洗颅骨表面， 以使颅骨矢状缝及冠状缝更加清晰， 便于精确定位。 以前囟作为参照点， 对参照点进行标记并记录其对应坐标， 依据大鼠脑立体定位图谱[8]以及经验确定内侧前额叶及伏隔核2个脑区的坐标并进行标记。 内侧前额叶坐标如下： 前囟前3 mm，矢状缝旁开0.7 mm， 颅骨表面下4 mm。伏隔核坐标如下：前囟前0.8 mm，矢状缝旁开1.2 mm，颅骨表面下6～7 mm。标记完毕后，用微型颅骨钻在标记点处钻孔以暴露脑区。同时，打开RM6240型系统以及SWF-1D微电极放大器， 调整软件控制界面， 以便观察电信号。 将固定于操作臂上的刺激电极缓慢植入内侧前额叶， 接着将记录电极缓慢植入到伏隔核， 在植入电极的同时观察信号，待诱发场电位出现时， 停止电极植入。 需要注意的是， 由于大鼠个体差异， 因此电极植入的实际深度和预设深度有一定有出入。

确定信号后，异氟烷被用来维持大鼠麻醉，待麻醉稳定后，开始采集信号。信号经过0.8～100 Hz带通滤波后，采用10 kHz采样频率采集数据，电位响应敏感度为1 mV/div。待信号稳定后，开始实验。首先，测量刺激电流与场电位幅度反应曲线。其次，根据反应曲线，调整场电位幅度保持在最大幅度40%～50%的刺激电流作为基线刺激，开始持续记录场电位信号(每30 s刺激一次)至少1 h。最后，场电位信号数据通过MATLAB以及pClamp10软件离线分析，并对数据进行归一化处理。需要注意的是，在信号采集过程中确保动物体温稳定。

1.5 组织学观察

实验结束后， 首先对脑区进行电损毁， 电流强度为0.2 mA， 持续时间为10 s。 然后进行灌流，灌注约250 mL生理盐水后， 再缓慢灌注250 mL质量分数为4%的甲醛溶液。 继而取出脑组织置于质量分数为4%的甲醛溶液中后固定48 h， 再转入质量分数为30%蔗糖溶液进行脱水48～96 h， 并保存在冰箱(4 ℃)里以待冰冻切片。 利用冰冻切片机进行连续冠状切片(厚度为30 μm)， 将包含内侧前额叶和伏隔核脑区的脑片贴片， 风干后利用尼氏染色液进行染色， 脑片经一系列脱水和透明处理后迅速用中性树胶封片。 用SMZ745T型解剖镜成像系统观察记录电极与刺激电极尖端位置， 并拍照。

1.6 统计学分析

采用统计学软件SPSS16.0对数据进行统计分析，数据呈现为平均值±标准误差。应用重复方差检验分析信号随时间变化的显著性，显著性水平P<0.05视为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 在体记录方法

利用自制电极进行在体诱发场突触后电位记录的方法见图1。图1(a)所示为2股镍铬合金丝，被用来作为刺激电极和记录电极；需要注意的是，电极与基座封闭要严密，不然电信号易受到干扰，引入噪音。图1(b)所示为在刺激电极未刺激之前记录的基底噪音，平均电压为-20～20 μV，基底噪音较理想。图1(c)所示为刺激电极和记录电极在相应脑区位置的示意图，如方法中所述，记录电极向动物尾部方向倾斜10°；需要注意的是，在开颅时避免脑组织出血，另外，内侧前额叶靠近矢状缝，需要精确定位以防止破坏矢状缝下血管。图1(d)所示为场电位代表波形(10个连续记录的波形叠加)，2条虚线之间的垂直距离被测量为电压幅度，即刺激伪迹(图中正峰值)前3 ms窗口内电压平均值与负峰值左右2 ms窗口内电压平均值之间的差值。RM6240系统自带软件并不能满足本研究的数据分析需求，因此，本文中建立了基于pClamp10信号分析软件的数据分析方法。利用MATLAB软件将RM6240系统生成的数据文本文件转变为pClamp10软件可读的文本文件，随后将数据导入pClamp10软件，应用其强大的波形数据分析功能对场电位幅度值进行批量分析及输出。

2.2 场电位信号

内侧前额叶-伏隔核通路中诱发场突触后电位见图2。 图2(a)所示为代表性刺激电流-场电位反应曲线， 图中灰色点幅度值对应于内图中场电位波形， 刺激电流依次为0.4、 0.7、 0.8、 1.8、 2.0 mA； 场电位随着刺激电流的增大而增加， 在刺激电流为1.8 mA时达到饱和。 图2(b)所示为代表性场电位随时间的变化(60 min)， 每个数据点代表5个连续记录波形的叠加， 信号保持相对稳定。 图2(c)所示为重复方差分析结果，P=0.25显示场电位随时间并无显著性变化， 表明该记录系统平台至少可以稳定记录信号1 h。 图2(d)所示为代表性组织检测图， 在记录过程中要保持麻醉水平及动物体温稳定， 若二者发生变化，可引起信号的变化。

3 讨论

本文中主要针对RM6240生物信号记录系统在记录诱发场突触后电位中的应用，对RM6240系统中场电位信号数据分析方法进行了改进。研究结果显示，RM6240系统可以记录到内侧前额叶-伏隔核通路中诱发场突触后电位，且信号至少能够稳定地维持1 h。

本研究中应用的电极是镍铬合金丝电极，除了这种材质的电极外，玻璃电极、铂铱合金丝电极以及钨丝电极也常被用于电生理研究[9-11]。这些材质的电极具有很好的组织(如脑组织)亲和性，不易引起组织炎症反应。一般来讲，玻璃电极易破碎，通常被用于麻醉状态下的急性实验，而金属电极则可以被埋植在动物脑组织内，适合于清醒自由活动时的长期或慢性实验[12-13]。另外，玻璃电极制作需要特定的设备仪器，而金属丝电极制作相对简单。在具体应用时应依据实验目的及实验条件选择合适的电极材料。

RM6240系统相比于国外的同类电生理仪器设备价格便宜，已在大学电生理教学实验中广泛应用，且方便搭建场电位记录平台，但是，该平台仍然存在一些不足。1)该系统抗干扰能力差，需要放置在屏蔽箱中，限制了该系统应用于清醒自由活动条件下诱发场电位的记录，尤其是与动物行为的同步记录。2)为了适应本实验程序要求，需要用到同步触发功能，但是RM6240型系统对每一次刺激产生的场电位信号储存为独立子文件，为数据的批量分析带来了挑战。3)该系统本身的数据分析功能不完善，场电位幅值测量不够灵活。鉴于后2点，本文中探索了用MATLAB批量处理由该系统导出的所有子文件(格式为文本文件.txt)，然后应用pClamp10软件进行数据分析。结果表明，该方法具有可行性，进而为后续实验数据分析奠定了基础。

如前言所述，内侧前额叶投射大量谷氨酸能纤维至伏隔核。Moussawi等[3]研究表明，刺激内侧前额叶时在伏隔核内记录的场电位是谷氨酸介导的兴奋性突触后电位，因此，通过记录内侧前额叶-伏隔核场突触后场电位，可以探测2个脑区间谷氨酸能突触传递的状态。另外，根据研究目的以及涉及的动物行为模型，比如研究情绪相关的学习记忆，该平台可以被用来记录基底外侧杏仁核-伏隔核通路中诱发场突触后电位，从而在环路水平上探究情绪相关学习记忆的内在神经机制[14-16]。

4 结语

综上所述，本文中应用RM6240生物信号记录系统以及自制的镍铬合金丝电极，记录了内侧前额叶-伏隔核场突触后场电位，信号至少能够稳定地维持1 h。另外，结合MATLAB和pClamp10软件有效地解决了RM6240系统数据分析的局限性，为后续实验建立了完善的数据分析框架。最后，尽管此平台操作相对难度较大，但是能够为本科生应用RM6240系统开展诱发场电位实验提供参考，可用于提高学生实验操作技能以及创造性思维能力。

致谢：非常感谢艾洪滨教授在撰稿过程中给予的指导和建议。