TIP30逆转人非小细胞肺癌吉非替尼耐药的实验研究*

肺癌是世界范围内发病率最高的恶性肿瘤［1］，其中80%～90%为非小细胞肺癌（non-samll cell lung cancer，NSCLC）［2］。近年来，随着对分子靶向药物研究的不断深入，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosinekinase inhibitor，EGFR-TKIs）类药物在晚期NSCLC治疗方面取得了突破性进展，有效地改善了晚期NSCLC患者的无进展生存期［3］。吉非替尼是第一代EGFR-TKIs类药物，是晚期NSCLC一线治疗药物，但治疗一段时间后（中位时间为6～12个月）大部分患者会产生获得性耐药［4］。目前的研究资料认为核内化EGFR是NSCLC吉非替尼耐药的可能机制之一［5-7］。核内化EGFR即EGFR本身内化进入细胞质，跨膜转运进入细胞核，进而调节相关基因的转录［8］。TIP30/CC3，又称 HTATIP2（HIV-1 Tat interactive protein 2）是一种抑癌基因，具有促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管形成和抑制肿瘤转移等多种生物功能［9］。现有研究表明，TIP30参与EGFR信号通路的负向调控［10-11］，因此，推测TIP30可能与NSCLC吉非替尼耐药有关。本研究观察过表达TIP30对人非小细胞肺癌吉非替尼耐药细胞PC9/GR耐药的影响，对实验结果进行分析并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人非小细胞肺腺癌吉非替尼敏感细胞株PC9购于南方医科大学实验室，吉非替尼耐药株PC9/GR由广东省人民医院实验室馈赠。二者分别用含10%胎牛血清的RMPI 1640和高糖DMEM于37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.1.2 药物及试剂 吉非替尼购于美国Selleckchem公司，EGF购于美国Selleckchem公司，慢病毒购于苏州吉玛基因公司，抗TIP30抗体、抗MEK抗体、抗p-MEK抗体、抗ERK抗体、抗p-ERK抗体、抗AKT抗体、抗p-AKT抗体、抗EGFR抗体均购于美国Abcam公司，抗β-Action抗体、抗Lamin B抗体购于美国Bioworld公司。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒转染上调TIP30 取对数生长期，生长状态良好的非小细胞肺癌吉非替尼耐药细胞株PC9/GR于转染前18～24 h消化接种于24孔板中，细胞密度为每孔3～5×104个，待细胞密度为40%～60%时，进行转染；0.4 mL无双抗含10%胎牛血清的DMEM完全培养基加入终浓度为5 μg/mL凝聚胺溶液，分别将病毒原液30 μL加入至稀释液中；将之前培养的24孔板细胞取出，弃去原先培养液，PBS洗涤1次，分别加入含有Lv-TIP30、Lv-NC配置好的病毒液，37℃、5%C02培养箱中培养过夜；嘌呤霉素筛选培养。免疫印迹法检测转染效果。

1.2.2 细胞增殖抑制率检测 采用CCK8法。取对数生长期的PC9、PC9/GR、PC9/GR-LVTIP30、PC9/GRLVNC细胞，各组细胞稀释为5×104个/mL单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100 μL，培养24 h；将其分为吉非替尼处理组（吉非替尼药物浓度梯度设定：0、0.625、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L）和非吉非替尼处理组；吉非替尼处理组，按药物浓度梯度加入各组细胞，继续培养48 h后弃去旧液，PBS洗涤1次，每孔加入100 μL含10%CCK8的反应液，孵育30 min后，酶标仪上测OD450值；非吉非替尼处理组分别于24、48、72 h按同样的方法用酶标仪测OD450值。细胞存活率（%）=［（实验组OD450值-空白组OD450值）/（对照组OD450值-空白组OD450值）］×100%；耐药倍数=耐药细胞IC50/敏感细胞IC50；逆转指数=使用逆转剂前IC50/使用逆转剂后IC50。每组浓度5个复孔，独立重复实验3次。

1.2.3 迁移能力检测 采用划痕修复实验。取对数生长期的PC9/GR、PC9/GR-LVTIP30、PC9/GR-LVNC细胞，其中PC9/GR细胞为空白对照，PC9/GR-LVNC细胞为阴性对照，用无血清的培养基调整细胞密度，将细胞种植于6孔板中，每孔约1×106个细胞，使细胞在6孔板中均匀平铺，置于在37℃、5%C02孵箱中过夜；24 h后观察，待细胞均匀单层铺满6孔板时，用200 μL的枪头在各孔的单细胞层上轻轻的制作划痕，保证力道一致，划痕粗细一致；随机将其分为非吉非替尼处理组和吉非替尼处理组，按分组加或不加含5μmol/L吉非替尼的无血清DMEM培养基，放置于37℃、5%CO2孵箱中继续培养；划痕后0、24、48 h每个孔随机选5个视野拍照，观察划痕愈合能力。愈合率（%）=［（愈合前划痕两侧细胞间距离-愈合后划痕两侧细胞间距离）/愈合前划痕两侧细胞间距离］×100%。

1.2.4 侵袭能力检测 采用Transwell法。取对数生长期 PC9/GR、PC9/GR-LVTIP30、PC9/GR-LVNC 细胞，随机分为非吉非替尼处理组和吉非替尼处理组，按分组加或不加含5 μmol/L吉非替尼的培养基，处理48 h后，正常消化离心，无血清培养基重悬，调整细胞浓度1×106/mL。用1:10倍数稀释的Matrigel胶包被底部有8 μm孔径的Transwell小室，将小室放置在24孔板内，每个小室加基础培养基稀释后的胶100 μL；置于37℃孵箱孵育30 min以上，后吸出小室残余液体，向上室加入200 μL稀释好的细胞悬液，下室加含20%FBS完全培养基500 μL，37℃、5%CO2细胞培养箱孵育48 h。取出细胞，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，0.1%结晶紫500 μL染色30 min，冲洗干净，空气干燥；显微镜下拍照，然后计数同时穿过Matrigel胶和聚碳酸酯膜的细胞数。

1.2.5 EGFR下游信号通路相关蛋白表达检测 采用免疫印迹法。取对数生长期PC9/GR、PC9/GRLVNC、PC9/GR-LVTIP30细胞，将细胞种植于6孔板中，每孔约1×106个细胞，随机分为非吉非替尼处理组和吉非替尼处理组，按分组加或不加含5 μmol/L吉非替尼的培养基，处理48 h后，换无血清培养基，置于37℃、5%C02孵箱中过夜；次日每组均以100 ng/mL EGF处理30 min；取出细胞，4℃的PBS洗涤3次后每个培养皿中加入200 μL裂解液，摇床上裂解30 min，充分裂解后用细胞刮将细胞碎片刮下分别收集到对应EP管中；4℃离心机，14 000 rpm离心20 min；取管中含蛋白的上清液，转移至新的EP管。采用SDS-PAGE凝胶电泳分离，电泳完湿转至PVDF膜，转膜后奶粉封闭2 h，加入一抗4℃孵育过夜。次日TBST洗膜3次，15 min/次；加入HRP标记的二抗，室温下孵育1 h，TBST洗膜3次，15 min/次。进行ECL化学发光反应及曝光，以β-Action为内参，独立重复3次。EGFR下游信号通路相关蛋白（MEK、P-MEK、ERK、P-ERK、AKT、P-AKT）蛋白表达相对量以目的蛋白灰度值与β-Action蛋白灰度值的比值表示。

1.2.6 核内EGFR表达检测 采用免疫印迹法。取对数生长期PC9/GR、PC9、PC9/GR-LVTIP30细胞，将细胞种植于6孔板中，每孔约1×106个细胞，置于37℃、5%C02孵箱中过夜；采用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽取试剂盒，提取核蛋白，电泳转膜显影过程参照1.2.5的方法。核内EGFR表达相对量以EGFR蛋白灰度与Lamin B蛋白灰度值的比值表示。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件。计量资料以x±s表示。两组间均数比较采用两独立样本t检验分析。多组间均数比较采用完全随机设计的方差分析统计方法，多重比较采用LSD检验（方差齐）或Dunnett's T3检验（方差不齐）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢病毒转染后各细胞TIP30蛋白表达的比较

与PC9/GR细胞相比，TIP30-1和TIP30-2细胞的TIP30的蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。见图1。

2.2 各组细胞存活率比较

非吉非替尼组中，PC9/GR-LVTIP30细胞的增殖能力明显低于其他细胞，差异具有统计学意义（P＜0.05）。吉非替尼处理组中，上调TIP30组细胞存活率明显低于其他组细胞（P＜0.05）；阴性对照组NC与对照组PC9/GR相比，差异无统计学意义（P＞0.05，图2）。计算出PC9、PC9/GR、PC9/GR-LVTIP30、PC9/GR-LVNC各自的IC50分别为（0.11±0.97）μM、（29.78±1.47）μM、（1.18±0.72）μM、（27.00±1.43）μM。由此计算出耐药细胞株PC9/GR的耐药倍数为278倍；结果显示PC9/GR-LVTIP30细胞的IC50较正常耐药细胞株PC9/GR明显降低，逆转耐药倍数为25.24。

2.3 各组细胞伤口愈合率比较

非吉非替尼处理组内，与PC9/GR细胞相比，上调TIP30的PC9/GR-LVTIP30细胞的伤口愈合能力明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。5 μmol/L吉非替尼处理组PC9/GR-LVTIP30细胞伤口愈合率与5 μmol/L吉非替尼处理组PC9/GR细胞、非吉非替尼处理组PC9/GR-LVTIP30细胞比较，显著受到抑制，且两两比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）。时间之间同样差异有统计学意义（P＜0.05）。阴性对照组PC9/GR-LVNC细胞与空白对照组PC9/GR细胞相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

图1 外源性上调TIP30

图2 过表达TIP30对PC9/GR细胞增殖能力及对吉非替尼敏感性变化的影响

2.4 各组细胞侵袭能力比较

5 μmol/L吉非替尼处理组PC9/GR-LVTIP30细胞侵袭细胞数明显低于其他细胞，差异具有统计学意义（P＜0.05）。此外，非吉非替尼处理组内，上调TIP30的细胞侵袭细胞数显著低于其他组细胞，有显著性差异（P＜0.05）。阴性对照组PC9/GR-LVNC与空白对照组PC9/GR之间的差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4。

2.5 各组细胞EGFR下游信号通路相关蛋白表达比较

与吉非替尼敏感株PC9相比，吉非替尼耐药株PC9/GR细胞的p-MEK、p-ERK、p-AKT表达明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05，图5）；而PC9/GR细胞过表达TIP30可以一定程度抑制p-MEK、p-ERK、p-AKT蛋白表达，差异具有统计学意义（P＜0.05）。PC9/GR-LVNC与空白对照组PC9/GR相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图6。

图3 过表达TIP30对PC9/GR细胞伤口愈合能力及对吉非替尼敏感性变化的影响

2.6 各组细胞核内EGFR表达情况比较

NSCLC吉非替尼耐药株PC9/GR细胞核内EGFR表达水平明显高于敏感株PC9细胞；而过表达TIP30可以导致PC9/GR细胞核内EGFR表达水平明显降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见图7。

图4 过表达TIP30对PC9/GR细胞侵袭能力及对吉非替尼敏感性变化的影响

图5 Western blot检测耐药株PC9/GR细胞EGFR下游信号通路相关蛋白表达变化

A：NSCLC吉非替尼耐药细胞株中存在EGFR下游信号通路的广泛激活；B：PC9/GR耐药细胞中p-ERK/p-AKT/p-MEK蛋白表达量均明显高于敏感株PC9；*P＜0.05，与PC9/GR空白对照组比较

图6 Western blot检测过表达TIP30后EGFR下游信号通路相关蛋白表达变化

图7 Western blot检测过表达TIP30后核内EGFR表达变化

3 讨论

吉非替尼耐药是EGFR基因突变型NSCLC治疗的主要难题之一。TIP30对肺癌的发生、发展和转移有明显的抑制作用［12-13］。TIP30与肺癌关系的研究已经进入了一个全面、快速发展的时期，但是TIP30对肺癌耐药性影响的报道较少。前期实验中我们发现，NSCLC吉非替尼耐药株PC9/GR中TIP30蛋白显著低于敏感株PC9，因此我们推测：TIP30参与吉非替尼耐药。为进一步研究TIP30对NSCLC吉非替尼耐药的作用，本研究构建了TIP30慢病毒载体，采用基因转染的方法，外源性上调TIP30，成功筛选出稳定过表达TIP30的耐药细胞株进行后续实验。

CCK8实验结果显示吉非替尼作用于PC9、PC9/GR、PC9/GR-LVTIP30细胞的IC50分别为（0.11±0.97）μmol/L、（29.78±1.47）μmol/L、（1.18±0.72）μmol/L，耐药倍数278，表明PC9/GR细胞确实对吉非替尼耐药；过表达TIP30的PC9/GR耐药细胞株吉非替尼IC50明显低于对照组细胞，逆转耐药倍数25.24，表明过表达TIP30一定程度上恢复了PC9/GR对吉非替尼敏感性。此外，非吉非替尼处理组实验结果发现，过表达TIP30的PC9/GR细胞的增殖速度较PC9/GR细胞显著下降，表明过表达TIP30能够抑制NSCLC吉非替尼耐药细胞PC9/GR的增殖。综上所述，过表达TIP30抑制耐药细胞PC9/GR体外细胞增殖，并且能够在一定程度上恢复耐药细胞PC9/GR对吉非替尼的敏感性。结合相关参考文献［14-15］，本研究选取5 μmol/L吉非替尼工作浓度用于后续研究。划痕修复和Transwell侵袭的实验结果显示TIP30可以抑制NSCLC吉非替尼耐药细胞PC9/GR的迁移和侵袭能力，并且能提高NSCLC耐药细胞对吉非替尼的敏感性，一定程度上逆转PC9/GR吉非替尼耐药。

现有研究表明，尽管吉非替尼耐药机制复杂，但均存在EGFR下游信号通路的广泛激活［6］，EGFR可以通过多种机制参与调控肿瘤的增殖、凋亡、侵袭和迁移等［16］。对肺癌的研究发现，TIP30基因敲除小鼠肺泡细胞和肿瘤细胞中EGFR下游信号通路相关蛋白p-MEK、p-AKT、p-ERK等表达上调，表明TIP30参与调控EGFR下游信号通路的活性［11］，而NSCLC吉非替尼耐药与EGFR信号通路激活有关，所以有理由认为TIP30通过调控EGFR参与NSCLC吉非替尼耐药。本研究采用免疫印迹方法检测NSCLC吉非替尼敏感细胞PC9和耐药细胞PC9/GR中EGFR下游信号通路相关蛋白的表达，发现吉非替尼耐药细胞株PC9/GR较敏感株PC9的EGFR下游蛋白p-AKT、p-MEK、p-ERK表达均显著上调，表明NSCLC吉非替尼获得性耐药与EGFR下游信号通路的激活有关，这与推测一致。为验证TIP30是否通过调控EGFR信号通路参与NSCLC吉非替尼耐药，本研究行免疫印迹实验发现，NSCLC吉非替尼耐药株PC9/GR过表达TIP30后较正常耐药株PC9/GR的EGFR下游蛋白p-AKT、p-MEK、p-ERK活性降低，以上实验结果表明，TIP30通过抑制EGFR下游信号通路相关蛋白p-AKT、p-MEK、p-ERK的表达活性参与吉非替尼耐药。

目前有研究显示在NSCLC中存在配体活化后的EGFR内化现象，吉非替尼-EGFR复合物内化进入细胞内，复合物在囊泡内分裂，激活核内的EGFR下游信号通路从而引发吉非替尼耐药［6，17］。另外，Huang等［7］研究发现在人基底细胞癌A431细胞中，发生EGFR核内化，从而促进了耐药蛋白BCRP/ABG2基因的转录，进而诱导发生乳腺癌细胞吉非替尼的耐药。由此，目前的研究已证明核内化EGFR信号通路参与吉非替尼的耐药。为进一步探讨TIP30调控NSCLC吉非替尼耐药是否与核内化EGFR有关，提取NSCLC敏感株PC9、耐药株PC9/GR和过表达TIP30的PC9/GR-LVTIP30细胞胞核内蛋白行免疫印迹实验，结果显示耐药株PC9/GR细胞核内EGFR表达明显高于敏感株PC9，而过表达TIP30导致PC9/GR-LVTIP30细胞胞核内EGFR表达水平降低。以上实验结果提示，TIP30参与调控吉非替尼耐药可能与抑制核内化EGFR有关。

综上所述，TIP30可以抑制NSCLC吉非替尼耐药细胞株PC9/GR的增殖、迁移和侵袭能力，并能逆转PC9/GR对吉非替尼的耐药性，在一定程度上恢复PC9/GR细胞对吉非替尼的敏感性，而这可能是TIP30通过抑制核内化EGFR下游信号通路活性实现的。本研究探索了新的逆转NSCLC吉非替尼耐药的分子靶点，为临床上治疗晚期NSCLC吉非替尼获得性耐药提供新的思路。