CTHRC1增强结直肠癌细胞侵袭能力促进结直肠癌转移的机制研究*

谭非 徐星 高品 苏向前

结直肠癌是全球范围内死亡率较高的恶性肿瘤之一［1］。自20世纪80年代以来，内镜技术的发展使得结直肠癌的早期诊断成为可能，死亡率呈下降趋势［2］，而晚期结直肠癌最主要的死亡原因为肿瘤转移。肿瘤在发展过程中突破基底膜对周边组织发动浸润与侵袭是转移过程中重要的早期事件，该表型对于肿瘤分期具有决定性的影响，也是区分良性与恶性肿瘤的重要标准［3］。因此，了解并抑制肿瘤的侵袭过程有利于改善结直肠癌的治疗。

miRNAs是非编码小RNA家族的重要成员，可以通过互补配对的形式结合于靶基因mRNA的3'UTR区，造成靶基因mRNA降解等，对靶基因的表达水平发挥负调控作用［4］。miR-520是与肿瘤发生密切相关的一个重要miRNA家族，其成员miR-524对脑胶质瘤的发生发挥抑制作用［5］。结直肠癌的发生同样受到miR-520的调控，前期本课题组的小临床样本量研究发现，miR-520d-5p在结直肠癌原发癌中表达水平发生下调，过表达miR-520d-5p会降低结直肠肿瘤细胞的侵袭能力［6］。而作为miR-520d-5p的潜在靶标基因，胶原三股螺旋重叠蛋白1（collagen triple helix repeat containing 1，CTHRC1）在多种肿瘤细胞中均被报道存在表达水平的上调，如胃癌［7］、结直肠癌［8-9］。在机制方面，基因CTHRC1可以通过上调MMP-7/MMP-9以及活化Wnt/PCP信号通路等方式促进肿瘤细胞的侵袭能力［10-11］。

本研究通过在结直肠癌细胞系中过表达基因CTHRC1探讨此基因对结直肠癌肿瘤细胞的侵袭能力的影响。进一步扩展临床样本总量对基因CTHRC1的表达规律开展了多中心分析，以确定基因CTHRC1在结直肠癌中的临床意义以及与miR-520d-5P的临床相关性，从而揭示基因CTHRC1与miR-520d-5P之间存在的平衡关系是否对正常结直肠功能的维持以及结直肠癌的发生存在影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例资料 选取2016年1月至2016年6月北京大学肿瘤医院行手术治疗的结直肠癌患者，取同一患者配对癌组织及正常组织于-80℃冰箱冻存备用，后期选取其中23对配对合格组织标本进行下一步实验。

1.1.2 细胞系及载体 人结直肠癌细胞株SW480、SW620、HCT116、LS174、HT29、LOVO和HEK293T均购自美国ATCC公司。根据美国国立生物技术信息中心（NCBI）提供的CTHRC1基因序列设计引物以扩增目的基因编码序列的全长，重组质粒的构建引物序列如下：CTHRC1（4123-3）-P1：GAGGATCCCCGGGTACCG GTCGCCACCATGCGACCCCAGGGC；CTHRC1（4123-3）-P2：TCCTTGTAGTCCATACCTTTTGGTAGTTCTTCAAT AATGATGCG。将回收的基因CTHRC1片段与GV287线性化片段进行连接反应，构建CTHRC1基因重组载体GV287-CTHRC1及GV287空载体质粒，按步骤制成含基因CTHRC1序列的慢病毒（GV287-CTHRC1）和空白对照病毒（GV287）［12］。

1.1.3 试剂 RMPI 1640培养基及胎牛血清购自美国Hyclone公司，Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司，CTHRC1和GAPDH引物均购自日本Takara公司。CCK-8试剂盒购自南京凯基公司，Transwell小室购自美国Coring公司，基质胶购自美国BD公司。兔抗人CTHRC1、GAPDH多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 6株结直肠癌细胞均以含10%胎牛血清的RMPI 1640培养基，在37℃、5%CO2饱和湿度的条件下适时传代培养。

1.2.2 Western blot检测基因CTHRC1在组织和细胞的蛋白表达水平 提取组织或细胞总蛋白，以BCA法测量蛋白浓度。10%SDSPAGE胶电泳后，恒流转移至PVDF膜上，含10%TBST脱脂牛奶室温封闭1 h，相应的一抗（1∶1 000）4℃孵育过夜，再以过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，10%TBST洗3遍，10 min/次。GAPDH为内参，SynGene显影仪显影。

1.2.3 CCK8细胞增殖实验 以100 μL/孔接种于96孔培养板中（每孔约800个细胞），每组设3个复孔，同时以Blank为对照（仅加培养基），连续培养1、2、3、4、5、6 d。检测前每孔加入10 μL CCK8试剂，37℃继续培养2～4 h后终止培养，以Blank为对照孔调零，酶标仪测定各孔吸光度值（OD值），波长为450 nm，细胞增殖能力以相对应OD值表示。各组取3孔平均值，进行统计学分析，实验重复3次。

1.2.4 Transwell小室细胞运动实验 所用Transwell小室内的膜材料为聚碳酸酯，选择孔径为8.0 μm的小室进行试验。取细胞计数为5×105/mL的单细胞悬液，加入200 μL悬液于内室，加入600 μL完全培养基于下室，37℃培养24～48 h。取出小室，吸掉培养液，去掉未穿过膜的细胞，多聚甲醛固定，考马斯亮蓝染剂染色30 min。显微镜下随机选取5个高倍视野计数穿过膜的细胞数。

1.2.5 Real-time PCR引物序列 U6：5'-TATTGCTT AAGAATACGCGGTAGAAA-3'；miR-520d-5P：5'-CAC ATTCTCTCAACCTATAATT-3'。

95℃预变性10 min，95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸34 s，40个循环，应用ABI7500定量PCR仪进行RT-PCR实验，检测各模版的Ct值，所有实验均重复3次，阴性对照以DNase/RNase-free H2O为模版。以Folds=2-ΔΔCt表示实验组与对照组目的基因表达的倍比关系，公式如下：ΔΔCt=［Ct（CTHRC1）-Ct（GAPDH）］实验组-［Ct（CTHRC1）］-［Ct（GAPDH）］对照组，重复3次实验，计算平均值。

1.2.6 CTHRC1相关miRNA的筛选和鉴定 1）以CTHRC1为检索词，在miRDB、miRanda和miRWalk等数据库中进行目标miRNA的靶向预测，选取上述数据库的预测结果交集，即预测得到可信度和准确性较高的靶向miRNA；2）扩增包括miR-520d-5p结合位点的CTHRC1 3'UTR基因片段（Wt CthrcI-3'UTR），并与pmirGLO双荧光素酶载体连接，同时将基因CTHRC1 3'UTR片段上的miR-520d-5p结合位点进行定点突变，制成相应基因片段（Mut Cthrcl-3'UTR）。应用荧光素酶报告系统检测miR-520d-5p与基因CTHRC1 3'UTR的结合。

1.2.7 miRNA的模拟类似物mimics及抑制物inhibitor的瞬时转染 在50 μL的减血清培养基（Opti-MEM）或其他无血清培养基加入20 pmoL的mimics或inhibitor混匀。采用50 μL Opti-MEM稀释1 μL Lipofectamin试剂并混匀，室温放置5 min。将稀释好的mimics或inhibitor和Lipofectamin试剂混合，室温放置20 min形成mimics（inhibitor）/Lipofectamin复合物。将100 μL上述混合物加入含有细胞和培养基的培养板中混匀。

miR-520d-5p的mimics和inhibitor序列如下：HasmiR-520d-5p mimics sense：5'-CUCUAGAGGGAAGCA CUUUCUG-3'；Anti-sense：5'-GAAAGUGCUUCCCUCU AGAGUU-3'；Has-miR-520d-5p mimics NC sense：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'；Anti-sense：5'-ACG UGACACGUUCGGAGAATT-3'；Has-miR-520d-5p inhi bitor：5'-CAGAAAGUGCUUCCCUCUAGAG-3'；HasmiR-520d-5p mimics NC：5'-CAGUACUUUUGUGUAG UACAA-3'。

1.3 统计学分析

采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。以Western blot检测结果采用配对样本t检验；CCK8实验结果的交互效应采用析因设计资料的方差分析，组间比较分别采用单向方差分析和独立样本t检验；Transwell小室细胞运动实验结果组间比较分别采用单向方差分析和独立样本t检验；取α=0.05为检验标准，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-520d-5P与基因CTHRC1在结直肠癌组织中的表达趋势

本课题组前期在42对配对结直肠癌及正常组织样本中发现，miR-520d-5P在肿瘤组织中表达低于正常组织，而基因CTHRC1在肿瘤组织中蛋白表达水平高于正常组织，两者呈负相关［6］。本研究再次收集的23对配对结直肠癌样本中得到类似结果。将两个中心的数据合并分析发现，在总数65对样本中仍然得到类似结果。正常组织中miR-520d-5P的表达水平高于配对肿瘤组织（t=-2.41，P=0.019），而CTHRC1在肿瘤组织中的表达量则高于正常组织（t=3.83，P=0.001），根据Spearman曲线结果显示两者呈负相关（r=-0.567，P＜0.001，图1）。

2.2 基因CTHRC1与miR-520d-5P在结直肠癌细胞中的调控关系

本研究发现基因CTHRC1可能为miR-520d-5P的下游靶基因，为了验证两者之间表达趋势负相关的内在机制，采用瞬转的方法将miR-520d-5P类似物转入SW480细胞系，结果发现基因CTHRC1蛋白表达水平的下调，（1.46±0.43）vs.（0.69±0.18），P=0.037。反之miR-520d-5P抑制物干扰miR-520d-5P，基因CTHRC1蛋白表达水平则出现上调，（0.78±0.22）vs.（1.76±0.33），P=0.032，提示基因CTHRC1受到miR-520d-5P的调控（图2A，B）。进而利用HEK293T细胞进行荧光素酶报告系统检测miR-520d-5P是否直接作用于基因CTHRC1的3'UTR区。将野生型CTHRC1-3'UTR与miR-520d-5P预测结合位点突变型CTHRC1-3'UTR分别与报告基因融合并转入HEK293T，并同时加入miR-520d-5P类似物或对照分子进行共转染。结果显示，野生型CTHRC1-3'UTR共转miR-520d-5P类似物后荧光素活性下降（P＜0.001），但突变型CTHRC1-3'UTR未明显受到miR-520d-5P类似物的影响（图2C），提示CTHRC1是miR-520d-5P的直接靶基因。

2.3 基因CTHRC1对结直肠癌细胞增殖和侵袭能力的影响

采用Western blot法在SW480、SW620、HCT116、LS174、HT29和LOVO结直肠癌细胞株中检测基因CTHRC1的蛋白表达水平。结果显示，SW480中基因CTHRC1的表达水平低于与其具有同源性的SW620细胞，（1.46±0.21）vs.（5.23±0.03），P=0.001（图3A）。

应用慢病毒系统将基因CTHRC1分别过表达于SW480和SW620细胞中，检测确认基因CTHRC1的过表达效果（图3B）。利用CCK8实验检测基因CTHRC1对于结直肠癌细胞增殖能力的影响并绘制生长曲线。结果显示，过表达基因CTHRC1使SW480和SW620细胞增殖能力下降，差异具有统计学意义（P＜0.05，图3C，D）。

采用Transwell法检测基因CTHRC1对结直肠癌细胞体外侵袭能力的影响。结果显示，过表达基因CTHRC1后SW480和SW620侵袭能力提高，且侵袭细胞数分别在48、72 h检测时间点差异具有统计学意义（P＜0.001，图3E～G）。

2.4 基因CTHRC1在结直肠癌组织中对肿瘤组织侵袭浸润能力的影响

为了明确基因CTHRC1蛋白表达水平与结直肠癌发生的相关性，本研究采用23对结直肠癌临床配对样本对基因CTHRC1蛋白表达水平进行Western blot检测，结果经配对t检验发现，肿瘤组织（1.302±1.016）显著高于正常组织（0.657±0.552），差异具有统计学意义（P=0.003，图4A，B）。

对临床结直肠癌病理样本进行免疫组织化学结果分析发现，在肿瘤组织中基因CTHRC1蛋白表达水平较高的细胞（图4C，蓝色箭头指示）对于周边组织表现出典型的侵袭行为（图4C，红色箭头指示），而且部分基因CTHRC1高表达水平的肿瘤细胞出现在血管位置（图4C，黄色箭头指示），提示基因CTHRC1表达水平升高促进肿瘤细胞的远端转移。上述研究结果表明，基因CTHRC1在结直肠肿瘤中的表达水平存在异常升高，进而可通过影响肿瘤细胞对周边组织的侵袭能力促进结直肠癌的转移。

图1 65对结直肠癌组织及其配对正常组织中CTHRC1与miR-520d-5p的表达水平及关系

图2 miR-520d-5P与CTHRC1的调控关系

图3 基因CTHRC1对结直肠癌细胞侵袭与增殖能力的影响

图4 基因CTHRC1对肿瘤组织侵袭浸润能力的影响

3 讨论

转移是恶性肿瘤的主要特征。在肿瘤转移的初始阶段，肿瘤细胞是否可以突破基底膜实现对于周边组织的侵袭与浸润对于肿瘤转移具有决定性意义［13］。肿瘤细胞的增殖能力对于肿瘤细胞的体外侵袭检测会产生一定的影响，即细胞的增殖能力可以通过影响细胞的总数量间接影响侵袭的细胞数量。本研究发现，过表达基因CTHRC1抑制肿瘤细胞的增殖能力，基因CTHRC1可能对于肿瘤细胞侵袭能力具有促进作用，而且有研究［14］指出，转移癌尤其是腹膜转移癌结直肠癌细胞的增殖受到抑制。

良性与恶性肿瘤的差异通常表现为是否具有侵袭能力，恶性肿瘤对于周边正常组织器官的侵袭程度可以直接影响肿瘤分期［3］。本研究结果显示，在结肠癌细胞株SW480与SW620中外源过表达过表达基因CTHRC1可以促进肿瘤细胞的体外侵袭能力，表明基因CTHRC1对于结直肠癌的恶性程度具有重要影响。肿瘤细胞的侵袭能力与增殖能力对于肿瘤的发展过程至关重要，但是由于侵袭与增殖分别促进肿瘤细胞离开原发部位和建立克隆性占位的不同过程，这两类特性从基因表达调控与能量代谢分配的角度分析通常不表现在肿瘤发展过程中的同一个时间、空间节点［13］。来自胶质母细胞瘤研究的报道［15］表明，高侵袭能力细胞系U87R4相对于低侵袭能力细胞系U87L4具有更强的成瘤能力以及化疗抗性，但是在增殖能力方面U87R4弱于U87L4，提示基因CTHRC1表达水平的上升对于调控肿瘤细胞在脱离原位过程中的侵袭与增殖能力的变化可能存在关键性的影响。

基因CTHRC1的异常高表达与多种癌症的相关性已有报道，且大多与癌组织的浸润和迁移有关［9］。胃癌的研究中同样发现基因CTHRC1在胃癌细胞中的表达上调能够促进胃癌细胞的浸润和迁移［7］。Ip等［16］研究发现，基因CTHRC1在非浸润型黑色素瘤原发癌组织中的含量远低于浸润型黑色素瘤的原发癌组织，而在黑色素瘤的转移组织中CTHRC1的表达量高于黑色素瘤的原发癌组织。本课题组的前期研究结果表明［8］，伴有腹膜转移的结直肠癌原发癌组织中基因CTHRC1的蛋白表达高于不伴腹膜转移的原发癌组织，且高表达基因CTHRC1的结直肠癌患者预后较差。在本研究中，基因CTHRC1被证明可以通过促进肿瘤细胞的侵袭能力，影响肿瘤的恶性程度。

诸多研究表明，肿瘤微环境对肿瘤细胞的生长、生存、浸润和转移有着密切的影响。改变肿瘤微环境可以使得肿瘤细胞更易从原发灶脱离进入循环系统，进而促进癌细胞的转移［17］。基因CTHRC1对应的蛋白是一种分泌型蛋白［18］，根据本研究结果推测，在结直肠癌形成的过程当中，转移性肿瘤细胞高表达基因CTHRC1，并且分泌到细胞外间质中，大量CTHRC1蛋白改变肿瘤微环境，促进癌细胞的浸润、生存和迁移。基于此，可将基因CTHRC1作为潜在的肿瘤诊断基因靶点对肿瘤的转移潜能进行预测，进一步设计小分子化合物中和肿瘤微环境中的CTHRC1蛋白，可能在一定程度上增强对肿瘤转移行为的控制。

本研究证实基因CTHRC1在结直肠癌具有转移潜能的细胞中异常高表达。基因CTHRC1的过表达提高了结直肠癌细胞的迁移能力，同时抑制了肿瘤细胞的增殖；而miR-520d-5p对基因CTHRC1的表达具有直接的抑制作用。肿瘤的发生、发展是多基因、多信号通路共同作用的结果，因此亟需大量实验证明在肿瘤转移过程中与基因CTHRC1相关的信号通路或关键因子。本研究为探索结直肠癌侵袭与转移的机制提供了新的视角，以期为深入理解结直肠癌转移的分子机制和寻找新的治疗靶点奠定基础。