风湿宁胶囊大孔树脂纯化工艺研究△

王鹏飞，刘培，叶花，王科，王嘉琛，段秀俊

（山西中医药大学，山西 榆次 030600）

风湿宁胶囊由青风藤、羌活、独活、川芎等药味组成，在治疗风寒湿邪，痹阻经络所致类风湿性关节炎，风湿性关节炎等方面疗效明显。大孔树脂现已广泛用于天然药物的分离与精制，近年来也逐步应用于中药复方制剂的工艺纯化处理[1-2]，本实验主要探讨大孔树脂纯化风湿宁胶囊水提醇沉液的工艺条件，为风湿宁胶囊的制剂开发应用提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Dionex高效液相色谱仪，PDA-100 Photodiode Array Detector检测器，Chromeleon 6色谱工作站；Bs2245型分析天平，KQ-500型超声波清洗仪，层析柱（Φ1.5 cm×30 cm）。

1.2 试药

青藤碱对照品（批号：0774-200206，供含量测定用）购自中国食品药品检定研究院。大孔树脂D101，购自天津光复精细化工研究所；大孔树脂NAK-9、X-5、HPD-100，购自陕西乐博生化科技有限公司；大孔树脂S-8，购自山东西亚化学工业有限公司。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 青藤碱的测定

参照文献方法[1-4]，取提取物约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%的甲醇溶液20 mL，超声处理20 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，制备供试品溶液。精密称取干燥至恒重的青藤碱对照品加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液的对照品溶液。分别精密吸取上述两种溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定。

色谱条件：Diamonsil C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5μm），流动相为甲醇-0.1%三 胺（35∶65），检测波长262 nm；柱温30℃（见图1）。

图1 风湿宁胶囊青藤碱测定液相色谱图

2.2 大孔树脂精制纯化工艺条件的考察

2.2.1 树脂的预处理 取新购大孔吸附树脂（D-101型、NKA-9型、S-8型、X-5型、HPD-100型），分别用95%乙醇浸泡数天后，依次用95%乙醇、纯水、5%HCl，5%Na0H、纯水冲洗备用[7-8]。

2.2.2 吸附条件考察

2.2.2.1 大孔树脂的筛选 称取处理好的5种型号树脂各5 g，置100 mL锥形瓶中，加入药液约70 mL，静置24 h，不时振摇。将树脂和药液一起全部装层析柱，药液自然洗脱，收集所有洗脱液。测定吸附前后药液中青藤碱含量，计算5种树脂的吸附量，结果见表1。

表1 不同型号树脂饱和吸附量比较

结果表明，D-101型大孔树脂的饱和吸附量最大，吸附性能最好，1 g树脂可以吸附6.308 4 g的药材，因此确定使用D-101型大孔树脂。

2.2.2.2 上样浓度的考察 取醇沉药液，浓缩后分别用纯水调至每1 mL药液相当于1 g原药材的浓度，即1∶1，同法制得浓度为 3∶1，5∶1，7∶1的上样液，分别上样，控制流速为7 d·min－1，收集洗脱液，测定原液与洗脱液中青藤碱含量，计算4个浓度药液的树吸附量，结果见表2。

表2 上样浓度考察结果

从实验结果看药液浓度为1∶1吸附效果最好。

2.2.2.3 上样流速考察 固定上样液的浓度为1∶1，分别以1、2、3、4 BV·h－1的流速上样，收集洗脱液，测定原液与洗脱液中青藤碱含量，计算不同流速下的树吸附量，结果见表3。

表3 不同上样流速吸附的考察

由实验结果来看，树脂对青藤碱的吸附能力极强。1 BV·h－1的流速能够得到最大的吸附量。

2.2.2.4 上样量的确定（吸附量泄露的考察） 使用醇沉液配制100 mL一定浓度的上样液，以1 BV·h－1的流速上样已装柱的经处理的树脂，每5 mL收集样品一份。选择第 1、4、7、8、9、10、11、12、13、15、17、18、20份洗脱液，各取 2 mL，用70%乙醇定容至25 mL，由0.45μL的滤头过滤，取续滤液，进行含量测定。以流出液的体积为横坐标，以指标性成分的含量为纵坐标绘制动态吸附曲线，见图2。

图2 泄露曲线

由泄露曲线可得，从第9份样品开始泄露，饱和上样量为45 mL，相当于1g树脂可吸附6.848 g的原药材。

2.2.3 洗脱条件的考察

2.2.3.1 洗脱溶剂的选择 取经处理的树脂4份，各5 g，考察不同洗脱剂浓度对洗脱的影响。将1∶1的上样液以1 BV·h－1的流速上样后，先用约100 mL的纯水洗脱，水液弃去不用。再分别用浓度为30%、50%、70%、90%的乙醇洗脱，收集洗脱液，调整浓度后，进行含量测定。按公式（1）计算回收率[9-11]。结果见表 4。

表4 不同浓度洗脱剂的洗脱效果比较

由结果来看，50%乙醇的洗脱量最大，洗脱效果最好，确定使用。

2.2.3.2 洗脱流速的考察 用最佳吸附条件饱和吸附后，经纯水洗脱，相同体积的50%乙醇分别以1、3、4、5 BV·h－1的流速洗脱，收集洗脱液，对洗脱液中的青藤碱进行测定，同2.2.3.1计算，结果见表5。

表5 洗脱流速的考察

从表5得出，随着流速增大，洗脱效果降低，但 1 BV·h－1与 2 BV·h－1的洗脱流速对洗脱效果影响不大，但2 BV·h－1的洗脱流速可节约一半的时间，极大地提高了工作效率，所以选择2 BV·h－1洗脱。

2.2.3 洗脱剂用量的考察 水洗饱和吸附的树脂后，用100 mL的50%乙醇以1 BV·h－1洗脱，每10 mL收集一份，共收集约10份，制备供试液，进行含量测定，计算结果做曲线图如图3。

图3 洗脱液中的含量变化

为保证洗脱完全，洗脱液的量定为10 BV。

2.2.4 验证试验 按照试验确定的吸附、洗脱的条件，进行验证，测定青藤碱的回收率，平均值为98.83%。

2.2.5 树脂使用次数的考察 为节约生产成本考察了大孔树脂不经再生的重复使用次数，实验连续使用六次，计算回收率，结果见表6。结果树脂在前五次使用时回收率均不低于98.44%，第六次使用时回收率显著降低至91.90%，表明树脂至少可以使用5次[12-13]。

表6 树脂使用次数的考察

3 讨论

本实验主要考察风湿宁胶囊的大孔树脂纯化工艺条件，实验结果表明D-101型大孔树脂对该制剂的吸附能力最强，上样液浓度为1∶1，上样流速为1 BV·h－1，上样量为1 g树脂折合原生药6.848 g，洗脱溶剂为50%的乙醇，洗脱流速为2 BV·h－1，洗脱量为10 BV；树脂至少可重复使用5次。

大孔树脂多用于单味中药的分离纯化，风湿宁胶囊由17味中药组成，采用传统的水提醇沉淀方法处理后服用量仍然较大，故实验设计将水提醇沉液进行大孔树脂纯化处理，并对其纯化工艺条件展开了系统研究。项目组曾考察了水煎煮、水提醇沉、水提醇沉大孔树脂处理三种工艺路线制备样品的抗炎止痛效果，结果无显著性差异，说明不管是醇沉淀还是大孔树脂吸附均未对药效成分的提取量及药效结果造成明显影响，说明风湿宁胶囊采用大孔树脂纯化处理具有较强可行性。

风湿宁胶囊虽然所含药味较多，但多数药味或因其所含成分水煎煮之后检出率低，或在多味中药中共存等，均不适于作为工艺考察的指标，实验选择了转移率较高的青藤碱作为工艺考察指标。

大孔树脂纯化是基于其吸附和筛选作用，洗脱较容易，因此用水或低体积分数乙醇预洗除杂时应考察其用量，以免目标成分的损失。经考察，风湿宁胶囊采用10 BV纯水预洗除杂基本未造成目标成分的损失。