金黄色葡萄球菌在广式烧腊制品中生长与控制的研究

张 洁,许喜林*,邹彦桐,翁文川

(1.华南理工大学 食品科学与工程学院,广东 广州 510640;2.广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心,广东 广州 510640)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是威胁食品安全的常见致病微生物,在熟肉制品中有较高检出率。肠毒素是引起金黄色葡萄球菌食物中毒的主要因子[1],金黄色葡萄球菌性食物中毒潜伏期短,多在食入可疑食品2～6 h发病。而且金黄色葡萄球菌的生长受环境因素的影响巨大[2],温度和湿度等都会影响它在熟肉制品中的生长情况。广式烧腊制品是一种在广东地区非常受欢迎的熟肉制品,其中又以叉烧、烧鹅以及烧鸭为典型代表,而大部分售卖方式为零售[3],食品安全难以得到保证。数据显不,2008-2011年间广东省出售的熟肉制品中,年平均检出率最高的食源性致病菌为金黄色葡萄球菌(S.aureus)(4.9%),其次为单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocyto genes)(0.9%),略高于沙门氏菌(Salmonella)(0.4%)[4]。目前,对于金黄色葡萄球菌已经有广泛深入研究,韩永斌等[5]研究紫甘薯花色苷色素抑制金黄色葡萄球菌作用的生长规律,黄潇等[6]对鱼糕中金黄色葡萄球菌生长模型的建立,曹慧等[7]对凉拌面中金黄色葡萄球菌生长模型的建立,王亭亭等[8]对馒头中金黄色葡萄球菌生长模型的建立,但专门针对广式烧腊制品中的金黄色葡萄球菌的研究尚属空白。

本实验通过模拟广式烧腊制品储藏的环境条件[9],研究不同外部条件(温度、pH、防腐剂)对金黄色葡萄球菌生长繁殖的影响[10-11],并探究广式烧腊制品的不同灭菌方式。将广式烧腊制品制成液体培养基,可以更好地反映金黄色葡萄球菌在广式烧腊制品生长的特性。通过测定金黄色葡萄球菌在叉烧、烧鹅、烧鸭、营养肉汤培养基以及7.5%氯化钠营养肉汤培养基中的生长曲线,探究不同灭菌条件对于叉烧、烧鹅、烧鸭中不同菌量的金黄色葡萄球菌的灭菌效果,最终确定可靠的灭菌方法,为广式烧腊制品的杀菌处理提供参考依据。食品中金黄色葡萄球菌的数量是产生肠毒素的主要条件,通过控制其生长繁殖对保障食品的安全具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种与样品

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus):华南理工大学微生物学实验室-80℃保存于体积分数为50%甘油中;叉烧:华南理工大学后勤市场;烧鹅、烧鸭:广州市天河区粤垦路五山金燕农贸市场。

1.1.2 培养基

营养肉汤培养基(蛋白胨10.0 g/L,牛肉膏粉3.0 g/L,氯化钠5.0 g/L,最终pH 7.4±0.2)、7.5%氯化钠营养肉汤培养基(蛋白胨10.0 g/L,牛肉膏粉3.0 g/L,氯化钠75.0 g/L,最终pH 7.4±0.2);Baird-Parker琼脂基础培养基(胰蛋白胨10.0g/L,牛肉膏粉5.0 g/L,酵母膏粉1.0 g/L,丙酮酸钠10.0 g/L,甘氨酸12.0 g/L,氯化锂5.0 g/L,琼脂15.0 g/L,最终pH 7.0±0.2)、卵黄亚硫酸钾增菌液(30%卵黄盐水2.083 mL,1%亚硫酸钾溶液0.417 mL,每支2.5 mL添加于47.5 mL Baird-Parker琼脂基础培养基中):广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.3 化学试剂

甘油:、氯化钠、氯化钾:上海润捷化学试剂有限公司;盐酸:广州化学试剂厂;甲醛:广州东红化工厂;氢氧化钠:南京化学试剂有限公司。所有实验试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

MP502B型电子天平、JA2003型电子分析天平、752紫外可见分光光度计:上海精科仪器有限公司;SW-CJ-1FD型超净工作台:苏州华科净化设备有限公司;GI36TW型全自动高压灭菌锅:致微(厦门)仪器有限公司;FX303-2型电热恒温培养箱:上海树立仪器仪表有限公司;LHS-80型恒温恒湿培养箱:上海百典仪器设备有限公司;Dragon Med型手动单道可调式移液器:上海大龙医疗设备有限公司;E4XLS型电动移液枪:美国瑞宁有限公司;FE20K Plus型pH计:梅特勒-托列多仪器(上海)有限公司;ES-1000W功率调节电炉:南海明辉五金电器厂。

1.3 方法

1.3.1 金黄色葡萄球菌活化

取一环-80℃、体积分数为50%甘油保存的新鲜金黄色葡萄球菌接种至营养肉汤培养基中活化(37℃恒温培养24 h),通过梯度稀释法得到浓度在103～104CFU/mL范围内的菌悬液,保存至冰箱待用。

1.3.2 广式烧腊制品液体培养基的制作

分别称量10.0g样品,加入90.0 g蒸馏水,用高速组织捣碎机以20 000 r/min转速进行捣碎[7],每次1 min,重复3次,撇去上层白色浮沫,均质。取10.0 g捣碎液,加入90.0 g蒸馏水,121℃、20 min灭菌后即制得叉烧、烧鹅以及烧鸭液体培养基。

1.3.3 金黄色葡萄球菌在不同液体培养基中的生长

在无菌条件下,分别接种103～104CFU/mL的金黄色葡萄球菌菌悬液0.05 mL至1L瓶灭菌后的叉烧、烧鹅、烧鸭液体培养基、营养肉汤培养基以及7.5%氯化钠营养肉汤培养基中,在37℃条件下恒温培养,每3 h取出一瓶液体培养基,利用紫外可见分光光度计测定波长560 nm处的吸光度值,绘制时间与OD560nm值曲线即可得到金黄色葡萄球菌生长曲线,以0 h时的培养基作为空白对照。

1.3.4 不同pH值对金黄色葡萄球菌在广式烧腊制品中生长的影响

将灭菌后的液体培养基调节好pH后,在无菌条件下接种103～104CFU/mL金黄色葡萄球菌菌悬液0.05 mL至pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的广式烧腊液体培养基中,分别在37℃条件下恒温培养24 h、在10℃条件下培养144 h后(金黄色葡萄球菌最适生长温度是在37℃,故选择短时间进行测量,而10℃是金黄色葡萄球菌产生毒素的最低温度,温度低,选择长时间进行培养)测定其在波长560 nm处的吸光度值,以0 h时的培养基吸光度作为空白对照。

1.3.5 含盐量对金黄色葡萄球菌在广式烧腊制品中生长的影响

在无菌条件下接种103～104CFU/mL金黄色葡萄球菌菌悬液0.05 mL至灭菌后的含盐量为0.5%、1.0%、3.0%、5.0%、7.0%、9.0%、11.0%、13.0%、15.0%的广式烧腊液体培养基中,分别在37℃条件下恒温培养24 h,在10℃条件下培养144 h测定24 h后其在波长560 nm处的吸光度值,以0 h时培养基吸光度值作为空白对照。

1.3.6 不同灭菌方式对广式烧腊制品中金黄色葡萄球菌的影响

将叉烧、烧鹅、烧鸭样品切成0.5～1.0 g左右大小,称取10.0 g置于培养皿中,接种使初始金黄色葡萄球菌量为105CFU/g、104CFU/g、103CFU/g,分别在不同的灭菌条件下对叉烧、烧鹅、烧鸭样品进行灭菌,利用平板计数法测定灭菌后的样品的金黄色葡萄球菌存活数量。灭菌条件尽可能模拟实际生活中对广式烧腊的灭菌操作,包括微波灭菌、高压灭菌、炒制灭菌。微波灭菌选用微波炉中高火档位灭菌。高压灭菌温度115℃,与家庭使用高压锅可以达到的工作温度接近。加热灭菌选择可调节式电炉,模拟家庭炒锅加热。

2 结果与分析

2.1 金黄色葡萄球菌在不同液体培养基中的生长

由图1可知,营养肉汤培养基中金黄色葡萄球菌的生长最为旺盛,叉烧、烧鸭、烧鹅培养基中其次,7.5%氯化钠营养肉汤培养基中则显不出相对较低的生长水平。在前6 h,5种液体培养基中的金黄色葡萄球菌生长缓慢,处于迟滞期,在6 h后,5种液体培养基中金黄色葡萄球菌菌数有着明显的增长,进入对数期。18 h后,营养肉汤培养基的OD560nm值增长放缓几乎趋于稳定;18～20 h叉烧、烧鸭、烧鹅液体培养基OD560nm值增长放缓,在20 h后OD560nm值趋于稳定;7.5%氯化钠营养肉汤培养基在20 h后OD560nm值也趋于稳定。

图1 金黄色葡萄球菌在不同培养基中的生长曲线Fig.1 Growth curves of Staphylococcus aureus in different media

2.2 pH值对金黄色葡萄球菌在广式烧腊制品中生长的影响

图2 37℃条件下pH值对金黄色葡萄球在广式烧腊制品中生长的影响Fig.2 Effect of pH value on the growth of Staphylococcus aureus in Cantonese barbecue at 37℃

由图2可知,在37℃条件下,叉烧、烧鹅、烧鸭液体培养基中的金黄色葡萄球菌在pH为5.0～8.0的范围内生长较好。在pH＜2.0时,金黄色葡萄球菌生长不明显;金黄色葡萄球菌在pH 8.0～9.0之间时,生长急剧下降;pH＞9.0之后,金黄色葡萄球菌生长减缓。

表1 10℃条件下pH值对金黄色葡萄球菌在广式烧腊制品中生长的影响Table1 Effect of pH value on the growth of Staphylococcus aureus in Cantonese barbecue at 10℃

由表1可知,在低温(10℃)条件下,金黄色葡萄菌在叉烧、烧鹅、烧鸭液体培养基pH为5.0～9.0范围内生长,比37℃条件下pH的生长范围有所减小,这一结果与赵学广等[12]的结果类似。

由图2及表1可知,金黄色葡萄球菌在37℃条件下pH的生长范围＞低温(10℃)条件下pH的生长范围,可以通过降低温度的同时降低pH或提高pH抑制金黄色葡萄球菌的生长,但是太高或者太低的pH对风味有较大影响。

2.3 含盐量对金黄色葡萄球菌在广式烧腊制品中生长的影响

图3 37℃条件下含盐量对金黄色葡萄球菌在广式烧腊制品中生长的影响Fig.3 Effect of salt content on the growth of Staphylococcus aureus in Cantonese barbecue at 37℃

由图3可知,37℃条件下叉烧、烧鹅、烧鸭液体培养基中的金黄色葡萄球菌在含盐量为0.5%～15.0%时均可生长,说明适宜温度下金黄色葡萄球菌是可以耐高盐的,有数据显不金黄色葡萄球菌有很好的耐盐性,可以在含盐量为10%～15%的培养基中生长[13]。李文杰等[14]的研究结果显不37℃的培养条件下在营养肉汤培养基中,当含盐量达到17%时,培养24 h后金黄色葡萄球菌全部死亡。但是,叉烧、烧鹅、烧鸭液体培养基中金黄色葡萄球菌的菌数均随着含盐量升高而呈现减弱的趋势,其中含盐量为8.0%时,金黄色葡萄球菌的生长有着明显的减弱。

表2 10℃条件下含盐量对金黄色葡萄球菌在广式烧腊制品中生长的影响Table2 Effect of salt content on the growth of Staphylococcus aureus in Cantonese barbecue at 10℃

由表2可知,10℃时叉烧、烧鹅、烧鸭液体培养基中金黄色葡萄球菌仅在含盐量为0.5%～5.0%时能够检测到生长,因此在低温下其耐盐度有所降低。赵学广等[12]的研究结果显不,在TBS培养基中,温度为10℃时,金黄色葡萄球菌在盐浓度为6.5%以下生长。本研究中广式烧腊液体培养基中金黄色葡萄球菌对盐的耐受度较低。

由图3及表2可知,对比在37℃以及10℃条件下叉烧、烧鹅、烧鸭液体培养基中金黄色葡萄球菌对含盐量的耐受度,可得出虽然金黄色葡萄球菌是耐盐微生物,但在低温下其耐盐度有所降低,氯化钠含量＞5.0%之后,对金黄色葡萄球菌在低温下的生长有很好的抑制作用。由于要保证产品本身的风味在含盐量4.0%可接受范围以内,在10℃条件下,无法通过提高含盐量来完全阻止金黄色葡萄球菌的生长,但提高含盐量可以一定程度抑制其生长。

2.4 不同灭菌方式对广式烧腊制品中金黄色葡萄球菌的影响

广式烧腊制品金黄色葡萄球菌的数量是肠毒素生成的重要条件,因此必须加以控制。根据广式烧腊制品再加工的实际情况,选取了微波灭菌(微波功率700 W)、高压灭菌(温度115℃、压力0.15 MPa)、炒制灭菌(温度200℃)三种方式对广式烧腊制品进行处理,不同初始菌量下产品灭菌后的存活菌数分别如表3、表4和表5所不。

表3 微波灭菌后广式烧腊中的存活菌数Table3 Survival amounts of Staphylococcus aureus in Cantonese barbecue after microwave sterilization

表4 高压灭菌后广式烧腊中的存活菌数Table4 Survival amounts of Staphylococcus aureus in Cantonese barbecue after autoclaved sterilization

表5 炒制灭菌后广式烧腊中的存活菌数Table5 Survival amounts of Staphylococcus aureus in Cantonese barbecue after stir-frying sterilization

由表3可知,同等初始菌量的条件下,灭菌时间越长,对金黄色葡萄球菌的灭菌效果越好。微波灭菌3 min,可以彻底杀灭初始菌量为104CFU/g和103CFU/g的金黄色葡萄球菌。由表4可知,115℃高压灭菌15 min以上,可以彻底杀灭3种样品中3个浓度的金黄色葡萄球菌。由表5可知,炒制灭菌6 min以上有较好的灭菌效果。

对比不同的灭菌方式,发现高压灭菌效果最好,115℃、20 min可以彻底杀灭3种样品中的3个浓度水平的金黄色葡萄球菌。微波灭菌(700 W)需3 min,炒制(加食用油炒制)灭菌需6min才能达到较好灭菌效果。分析这几种灭菌方式,灭菌不彻底的原因可能是,热量传导需消耗一定时间,样品内部的温度无法很快到达灭菌温度,以至于有金黄色葡萄球菌存活。另外,对比3种不同的样品,烧鹅的金黄色葡萄球菌存活率略高于烧鸭、叉烧。原因可能是,烧鹅以及烧鸭的结构复杂,在灭菌处理过程中要使样品的每一部分都均匀受热可能需要更长的时间,故在同样的时间下,叉烧的中金黄色葡萄球菌存活率低于其他两者。汪玲玲等[15]研究了不同减菌方法对于金黄色葡萄球菌的减菌效果,60℃加热5 min和18 W紫外照射15 min两种处理对金黄色葡萄球菌的最大比生长速率影响显著。

3 结论

通过对叉烧、烧鸭、烧鹅液体培养基、营养肉汤培养基和7.5%氯化钠营养肉汤培养基中金黄色葡萄球菌生长曲线的测定,得到生长趋势为前6 h生长缓慢,6～18 h增长迅速,18～20h生长开始稳定,并对比发现7.5%盐度对于金黄色葡萄球菌生长有一定的抑制作用,且抑制作用比起营养成分不足的影响要明显。

通过研究37℃以及10℃条件下不同pH的叉烧、烧鹅、烧鸭液体培养基对金黄色葡萄球菌的影响,结果显不在37℃条件下,金黄色葡萄球菌在pH 3.0～10.0范围内生长;在10℃时,金黄色葡萄球菌在pH 5.0～9.0的范围内生长。叉烧、烧鹅、烧鸭本身产品的pH是非常适宜金黄色葡萄球菌生长的,适当降低产品pH不能完全阻止但可抑制金黄色葡萄球的生长。

通过研究在37℃以及10℃条件下不同含盐量的叉烧、烧鹅、烧鸭液体培养基对于金黄色葡萄球菌的影响。在37℃时,叉烧、烧鹅、烧鸭液体培养基在含盐量≤15.0%时金黄色葡萄球菌均生长;在10℃条件下,含盐量≤5.0%时生长。广式烧腊制品的含盐量值一般在4.0%以下,可以发现提高其含盐量不能完全阻止但可抑制金黄色葡萄球的生长。

通过研究不同灭菌方式对于不同初始菌量的金黄色葡萄球菌在叉烧、烧鸭以及烧鹅中的灭菌情况,115℃高压灭菌20 min可对叉烧、烧鹅、烧鸭三种样品中金黄色葡萄球菌彻底灭菌。对于其他灭菌方法,推荐使用微波灭菌(700 W)3 min以上,蒸汽灭菌30 min以上,加热灭菌6 min以上。

本研究针对的是广式烧腊中金黄色葡萄球菌的生长与控制,与实际的微生物环境并不全然相同。从实际加工过程中对于广式烧腊产品的灭菌操作出发,探索彻底杀灭金黄色葡萄球菌的有效灭菌方法,可以为消费者提供指导性建议。故在后续的研究中,可以探究广式烧腊制品中沙门氏菌、常见的霉菌与金黄色葡萄球菌共生时,金黄色葡萄球菌的生长情况[16]。