山皮条水提物急性毒性试验及镇痛抗炎药效研究

云南省药物研究所/云南白药集团创新研发中心/云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室，云南 昆明 650111

山皮条为瑞香科Thymelaeaceae植物WikstroemiadolichanthaDiels，别名矮陀陀、竹腊皮。落叶小灌木，叶卵形或椭圆形，主根长圆锥形，有支根及少量须根，药用部分为其根皮。味辛、辣，微苦，性微温[1]。主要分布于四川、云南、贵州等地，多生长于石灰岩地带的向阳山坡上[2]。《滇南本草》中记载：山皮条“治妇人气逆，肚腹疼痛，宽中理气，胸膈肚腹膨胀，止面寒梗硬胀痛”。《昆明民间常用草药》中亦记载：山皮条“宽中理气，解郁，除疮毒。治肚腹冷痛，胸膈气胀，痨热，疮毒。”民间亦多用其治恶疮[2]。据此推断山皮条具有镇痛、抗炎之功效。实验对山皮条水提物进行小鼠灌胃给药急性毒性实验观察其安全性，采用醋酸致小鼠扭体实验和二甲苯致小鼠耳肿胀实验分别考察其镇痛、抗炎作用，为山皮条水提物的临床安全及应用提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 实验动物 SPF级昆明种小鼠，雌雄各半，周龄4～6周，体重18～22 g，由广东省医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(粤)2013-0002。饲养条件：室温为(25±2)℃，相对湿度40%～70%，塑料盒群养。喂SPF大小鼠生长繁殖饲料，自由饮水和进食。饲料生产于北京科澳协力饲料有限公司，许可证号：SCXK(京)2014-0010。

1.2 药品与试剂 山皮条水提物(批号：20151019，浅棕色粉末，提取率18.2%，云南省药物研究所化学研究室)。羧甲基纤维素钠(批号：20160602，国药集团化学试剂有限公司)；阿司匹林肠溶片(批号：BJ22649，Bayer Schering Pharma公司)；乙酸(批号：1202101，上海申博化工有限公司)；生理盐水(批号：A150413 G2，昆明南疆制药有限公司)；二甲苯(批号：20140701，重庆川东化工(集团)有限公司)。

1.3 仪器 JJ-2000 型电子天平(美国双杰兄弟(集团)有限公司常熟市双杰测试仪器厂)；PL-203型电子分析天平(METTER-TOLEDO(上海)有限公司)；ELGALA 613型超纯水机(英国ELGA LabWater/VWS(UK)Ltd )。

2 方法

2.1 小鼠灌胃给药急性毒性实验[3]

2.1.1 预试验 山皮条水提物能配制较高且利于小鼠灌胃的混悬液的浓度为0.5 g/mL(20.00 g/kg·bw)，以0.8倍作为剂量设置比，共设四个剂量，分别为20.00 、16.00、12.80、10.24 g/kg·bw剂量组(分别相当于生药109.89、87.91、70.33、56.26 g/kg·bw)。取SPF 级昆明种小鼠16 只，体重18～22 g，雌雄各半，实验前禁食不禁水6 h，随机分为4组，每组4只，雌雄各半，以灌胃最大容积40 mL/kg·bw分别灌胃给予相应剂量药物，观察动物一般症状及死亡情况，连续观察7 d。

2.1.2 LD50实验 根据小鼠灌胃给药急性毒性预试验结果，将山皮条水提物设置6个剂量组，即24.00、20.40、17.34、14.74、12.53、10.65 g/kg·bw(分别相当于生药131.87、112.09、95.27、80.99、68.85、58.52 g/kg·bw)，另设溶媒对照组(0.5%羧甲基纤维素钠溶液)。

取SPF 级昆明种小鼠70只，体重18～22 g，雌雄各半，随机分为7组，即溶媒对照组和不同剂量山皮条水提物组，每组10只，雌雄各半。小鼠禁食不禁水6 h后，山皮条水提物各剂量组按40 mL/kg体积灌胃给予相应供试品，溶媒对照组灌胃给予相同容积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液，观察给药后小鼠急性毒性反应、死亡情况、摄食量、二便、体重等情况，以后每天至少观察1次，连续观察14 d。对观察期死亡的动物进行解剖，观察结束后脱颈椎处死存活的动物，大体解剖观察各脏器、器官的体积、颜色、质地等有无异常。

2.2 醋酸致小鼠扭体实验[4]取SPF 级昆明种小鼠60只，体重18～22 g ，雌雄各半，随机分为5组，即模型对照组、阿司匹林组(400 mg/kg·bw)、山皮条水提物低、中、高剂量组(剂量分别为1.58、3.15、6.30 g/kg·bw)，每组12只。模型对照组按20 mL/kg体积灌胃给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液，其余各组按20 mL/kg的体积灌胃给予相应药物，每天1次，连续7 d。末次给药1 h后，按10 mL/kg体积腹腔注射0.6%的冰醋酸溶液(纯水配制)，记录注射后15 min内小鼠出现扭体反应(腹部内凹、伸展后肢、臀部抬高)的次数，并按下式计算其扭体抑制率：

扭体抑制率(%)=(1-给药组扭体次数/模型对照组扭体次数)×100%。

2.3 二甲苯致小鼠耳肿胀实验[5]取SPF 级昆明种小鼠60只，体重18～22 g，雌雄各半，随机分为5组，即模型对照组、阿司匹林组(400 mg/kg·bw)、山皮条水提物低、中、高剂量组(剂量分别为1.58、3.15、6.30 g/kg·bw)，每组12只。模型对照组小鼠按20 mL/kg体积灌胃给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液，其余各组按20 mL/kg的体积灌胃给予相应药物，每天1次，连续7 d。末次给药1 h后，各组小鼠于右耳耳廓两面按0.05 mL/只均匀涂抹二甲苯，左耳不做处理为对照。造模1 h后，脱颈椎处死各组动物，沿耳廓基线剪下双耳，用直径6 mm的打孔器于双耳同一部位切下等面积耳片，立即称重，按下式计算耳肿胀度和肿胀抑制率： 耳肿胀度=右耳质量-左耳质量 肿胀抑制率=(模型对照组平均肿胀度- 给药组平均肿胀度)/模型对照组平均肿胀度×100%。

2.4 统计学分析 实验数据以均数加减标准差(x±SD)的方式表示，采用SPSS 11.0统计软件进行统计分析。采用单因素方差分析比较组间数据，方差齐者用LSD检验，方差不齐则采用Dunnett's T3检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 小鼠灌胃给药急性毒性实验 小鼠灌胃给药急性毒性预试验中，20.00、16.00、12.80、10.24 g/kg·bw剂量组死亡动物数分别为4只、2只、1只、0只，死亡率分别为100%、50%、25%、0%。各组小鼠给药后主要出现俯卧、腹泻、翻正反射消失等中毒症状，直至死亡。死亡动物解剖观察，发现全部动物出现肺部充血现象。

正式实验中，小鼠灌胃给予山皮条水提物后，在0.5～4 h内出现毒性反应，主要表现为俯卧、腹泻、抽搐、翻正反射消失等症状直至死亡。动物给药后49 min开始有小鼠死亡，死亡时间集中在给药后48 h内，对死亡动物解剖观察，全部动物出现肺部充血现象，但未进一步进行病理检测。毒性反应症状发生时间和程度随给药剂量的降低而减轻，死亡动物数也相应减少。剩余小鼠行为活动逐渐趋于正常，至给药第3天恢复，试验期间，各组存活小鼠体重均持续增长。各组动物的毒性症状和死亡数量见表1。

观察期结束后脱颈椎处死存活的动物，进行大体解剖，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、卵巢、子宫、精囊、前列腺、睾丸、胃、肠及胸腔、腹腔，各脏器、器官的体积、颜色、质地等均无肉眼可见的异常。

在本实验所设计的实验条件和剂量范围内，山皮条水提物24 h内小鼠灌胃给药LD50为15.48 g/kg·bw(相当于生药85.05 g/kg·bw)，95%的可信区间为14.07～16.99 g/kg·bw(相当于生药量77.31～93.35 g/kg·bw)。

表1 山皮条水提物小鼠灌胃给药急性毒性试验各组动物毒性症状及死亡数

3.2 醋酸致小鼠扭体实验 山皮条水提物以1.58、3.15、6.30 g/kg·bw(相当于生药8.68、17.31、34.62 g/kg·bw)的剂量(给药剂量由小鼠灌胃给药急性毒性实验及药效实验预试验得出)连续灌胃给药7 d，与模型对照组比较，山皮条水提物3.15 g/kg·bw、6.30 g/kg·bw剂量组均能显著减少醋酸所致小鼠扭体反应的次数，差异具有统计学意义(P<0.01)。提示山皮条水提物具有明显的镇痛作用，见表2。

表2 山皮条水提物对醋酸所致小鼠扭体反应的影响(n=12，±SD)

注：与模型对照组比较，**P<0.01,***P<0.001。

3.3 二甲苯致小鼠耳肿胀实验 山皮条水提物以1.58、3.15、6.30 g/kg·bw g(相当于生药8.68、17.31、34.62 g/kg·bw)的剂量连续灌胃给药7 d，与模型对照组比较，6.30 g/kg·bw剂量组能显著降低二甲苯所致的小鼠耳肿胀度，差异具有统计学意义(P<0.01)。提示山皮条水提物具有抗炎的作用，见表3。

表3 山皮条水提物对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响(n=12，x±SD)

注：与模型对照组比：**P<0.01。

4 讨论

山皮条盛产于云南、四川等地，《滇南本草》中记载其主治肚腹疼痛，能止面寒梗硬胀痛[1]，民间亦多用其除疮毒，治肚腹冷痛[6]，但目前国内外对其药理作用的报道较少，杜仕榕[2]对山皮条的临床应用加以整理，将其佐以其他药材治疗慢性副鼻窦炎、尿路感染、乳腺炎等多种疾病，能清热败火、消炎祛毒，临床疗效确切。本实验对山皮条水提物进行小鼠灌胃给药急性毒性实验观察其安全性，采用醋酸致小鼠扭体实验和二甲苯致小鼠耳肿胀实验分别观察其镇痛、抗炎作用。

在急性毒性实验中，小鼠灌胃给予山皮条水提物后，在0.5～4 h内出现毒性反应，主要表现为俯卧、腹泻、抽搐、翻正反射消失等症状直至死亡，死亡动物全部出现肺部充血现象，由此推测山皮条对小鼠毒性作用可能涉及中枢神经、自主神经、肌肉及肺部等，相关机制有待进一步研究。试验期间，各组存活小鼠体质量均持续增长，但由于动物死亡较多，未对存活小鼠体质量进行统计。山皮条水提物24 h内小鼠单次灌胃给药LD50为15.48 g/kg·bw(相当于生药85.05 g/kg·bw)，95%的可信区间为14.07～16.99 g/kg·bw(相当于生药量77.31～93.35 g/kg·bw)，其毒性反应症状发生时间和程度随给药剂量的降低而减轻，死亡动物数量也相应减少，显示出剂量-反应关系。提示山皮条具有一定的毒性，在临床使用中要严格掌握其用量，避免使用过量而发生中毒。

醋酸致小鼠疼痛性扭体模型是目前国内外镇痛药物筛选的常用方法[7-8]，主要考察受试药物的外周镇痛作用，也适用于中枢镇痛药物的药理研究[9]，适于非甾体抗炎药镇痛药效的筛选[10]。其利用醋酸产生的化学刺激导致小鼠腹腔持久性疼痛，同时伴随急性炎症反应，刺激其脏层和壁层腹膜，引起小鼠疼痛性扭体反应[11-13]。结果表明，山皮条水提物能明显减少小鼠疼痛性扭体的次数，具有一定的镇痛作用。二甲苯是化学致炎剂，对皮肤黏膜有较强的刺激作用，能诱导炎性物质的释放，导致毛细血管扩张、通透性增加、急性渗出和水肿等，与临床炎症症状相似，故常用于抗急性炎症药物的筛选[14-15]。实验结果表明，山皮条水提物能明显抑制二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀，具有一定的抗炎作用。

综上，山皮条水提物具有明显的抗炎镇痛作用，其作用机制还需进一步的研究；但也有一定的毒性，在临床使用中要严格掌握其用量。