苗药理气活血滴丸对大鼠慢性心力衰竭的保护作用

长福*

1.贵阳中医学院基础医学院，贵州 贵阳 550025；2.贵阳中医学院药学院，贵州 贵阳 550025

慢性心力衰竭(Chronic Heart Failure,CHF)是器质性心脏病的最终结局，是威胁人类健康的主要疾病之一[1]。细胞凋亡是一个受基因调控的程序性细胞死亡过程，心肌细胞凋亡发生于多种心血管疾病，与心律失常和心脏功能障碍密切相关，在心力衰竭发生进程中起着关键性的作用[2-3]。

现代中医根据慢性心力衰竭的临床表现，将其归属于“心悸”“心痹”“心水”“心衰”“胸痹”等疾病范畴，气滞血瘀是慢性心力衰竭的常见证型[4-5]。理气活血滴丸，是根据贵州苗族民间验方结合传统中医药理论研制而成的一种中药复方制剂，其成分包括苗药米槁(又名大果木姜子)、薤白、川芎、冰片，具有温阳宽胸，理气活血功效，对心悸、胸闷、胸痛、气短、形寒等疗效显著，临床上主要用于治疗冠心病、心绞痛等[6]。近年来本课题组发现理气活血滴丸对再灌注损伤心肌组织具有保护作用[7-8]，本研究从左心室功能和心肌细胞凋亡方面探讨理气活血滴丸对大鼠CHF的保护作用，为临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠60只，体重(180±20)g，购自长沙天勤生物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(湘)2014-0010。

1.2 药物和试剂 理气活血滴丸，由贵州益佰制药股份有限公司提供，批号：20161002；马来酸依那普利片购自扬子江药业集团江苏制药股份有限公司，批号：20160806；盐酸异丙肾上腺素购自北京索莱宝科技有限公司，批号：I8480；大鼠脑钠尿肽(Brain Natriuretic Peptide, BNP)试剂盒购自上海鑫乐生物科技有限公司，批号：xl-Er0038；TUNEL染色试剂盒(In situ cell death detection kit-POD法)购自瑞士罗氏公司，批号：10279600。

1.3 仪器 HX-101E小动物呼吸机和BL-420S生物信号采集与分析系统，成都泰盟软件有限公司；RM2016转轮式切片机，德国徕卡(Leica)仪器有限公司；Thermo全功能酶标仪，美国ThermoFisher仪器有限公司；BA200Digital数码三目摄像显微镜，麦克奥迪实业集团有限公司。

2 方法

2.1 大鼠慢性心力衰竭模型建立及分组 雄性SD大鼠(60只)，适应性喂养1周，随机分为2组：对照组(10只)和CHF模型组(50只)。CHF模型组大鼠皮下注射ISO 170 mg/kg/d，连续注射2 d，每天1次，间隔时间为24 h，对照组注射等量的生理盐水，持续诱导4周[9-10]。之后测定血清BNP含量，模型组大鼠血清中BNP浓度与正常组相比显著升高，说明造模成功。CHF模型大鼠随机分为5组：模型组，依那普利组(10 mg/kg/d)，理气活血滴丸低剂量(43.75 mg/kg/d)、中剂量(87.50 mg/kg/d)、高剂量175.00 mg/kg/d)组，各组大鼠按相应剂量每天灌喂给药1次，连续给药4周。对照组和模型组大鼠灌胃等容积生理盐水。

2.2 血清BNP含量测定 采集大鼠腹主动脉血液，4 ℃，2500 r/min离心10 min，取血清，之后按照试剂盒说明书步骤测定血清中BNP的含量。

2.3 左心室功能监测 大鼠称重，腹腔注射20%乌拉坦麻醉后，仰卧位固定于实验台上。做气管插管，连接小动物呼吸机。分离右侧颈总动脉，结扎分离的颈总动脉远心端，动脉夹夹闭近心端。在动脉壁剪一小口，逆行刺入带肝素的静脉穿刺套管针，慢慢退出穿刺针，缓慢推进导管至左心室。穿刺套管与压力换能器连接，接入BL-420S生物信号采集与分析系统，记录左心室内压峰值(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP)、左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)和左心室内压最大下降速率(-dp/dtmax)。

2.4 TUNEL-POD染色法分析大鼠心肌细胞凋亡情况 切取左心室冠状面中部心肌组织块，4%多聚甲醛固定；固定后常规石蜡包埋，切片，常规脱蜡，37 ℃胰蛋白酶K处理25 min，PBS漂洗3次；切片滴加TUNEL反应混合液于暗盒中37 ℃处理1 h，PBS漂洗3次；滴加converter-POD液(连接辣根过氧化酶的荧光素抗体)，于暗盒中37 ℃处理30 min，PBS漂洗3次；DAB显色，再苏木素轻度复染。然后乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜检。凋亡细胞核颜色为浅黄色或棕黄色，阴性表达为蓝色，底色为白色。根据采集的图像统计凋亡细胞百分率(AI)：凋亡率=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%。

3 结果

3.1 理气活血滴丸对CHF大鼠血清BNP含量的影响 结果如表1所示，与对照组相比，模型组大鼠血清中BNP浓度显著升高(P<0.05)。与模型组相比，理气活血滴丸低剂量组大鼠BNP浓度降低，但差异无统计学意义(P>0.05)；理气活血滴丸中、高剂量组及依那普利组大鼠BNP浓度显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。

3.2 理气活血滴丸对CHF大鼠左心室功能的影响 与对照组相比，模型组大鼠左心室收缩压(LVSP)及左心室内压最大变化速率(±dp/dtmax)显著降低，左心室舒张末压(LVEDP )极显著升高，差异均具有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，理气活血滴丸低剂量组与模型组相比大鼠LVSP、LVEDP、左心室内压最大变化速率(±dp/dtmax)差异均无统计学意义(P>0.05)；理气活血滴丸中、高剂量和依那普利组大鼠LVSP和±dp/dtmax显著升高，LVEDP显著降低，差异均具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清BNP水平、左心室功能指标及心肌细胞凋亡率检测

注：与对照组比较，*P<0.05;**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

3.3 理气活血滴丸对CHF大鼠心肌细胞凋亡的影响 结果如图1所示：对照组大鼠心肌细胞凋亡阳性染色很少；模型组大鼠心肌细胞凋亡阳性染色明显增多；理气活血滴丸低剂量组与模型组比较，大鼠心肌细胞凋亡阳性染色变化不明显；理气活血滴丸中、高剂量组和依那普利组大鼠心肌细胞凋亡阳性染色明显减少。经统计各组心肌细胞凋亡率发现，见表1：模型组大鼠与对照组比较心肌细胞凋亡率显著增多，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，理气活血滴丸低剂量组大鼠心肌细胞凋亡率减少，但差异无统计学意义(P>0.01)，理气活血滴丸中、高剂量组和依那普利组大鼠心肌细胞凋亡率显著减少，差异具有统计学意义(P<0.01)。

4 讨论

心力衰竭是许多发展中的心脏病的最后阶段，是心脏病导致死亡的主要原因。在心力衰竭过程中，心肌细胞凋亡可降低心肌收缩力，从而促进心力衰竭[11-12]。本研究理气活血滴丸对心力衰竭大鼠左心室功能的改善作用及抑制心肌细胞凋亡作用。

临床上，血流动力学指标可直接反映心室舒张功能。LVSP是以等容收缩期结束时的左心室收缩压为基础，增强心室收缩或增加外周阻力，将导致LVSP增加；而LVEDP则是以等容收缩期结束时的左心室舒张压为基础的[13]。±dp/dtmax能反映心室壁张力的变化率，显示心肌纤维收缩和延长的最大速度[14]，所有这些都是常用的评价心肌收缩和舒张功能的特征[13]。BNP是一种重要的利钠肽，是临床心力衰竭的生物标志物。心力衰竭时血流动力学改变。由于血容量和心室壁张力的增加，心脏负荷聚集，因此，大部分储存在心室肌中的合成的proBNP被释放。Serine蛋白酶激活proBNP，产生活化的BNP。BNP的增加可反映左心室舒张末期压力的增加。在心力衰竭过程中，血清中的BNP浓度随着心力衰竭程度的增加而增加[15-16]。本研究表明理气活血滴丸能使慢性心力衰竭大鼠左心室收缩压( LVSP)、左心室内压最大变化速率(±dp/dtmax)显著升高，左心室舒张末压(LVEDP)显著降低和血清BNP水平显著降低，说明理气活血滴丸能明显改善慢性心力衰竭大鼠左心室功能。

CHF的发生是一个极其复杂的过程，目前还没有一个明确的发病机制[17]。但是研究表明，心肌细胞凋亡在心力衰竭形成过程中起着至关重要的作用[3]。本研究发现，理气活血滴丸能显著降低心肌细胞TUNEL染色的阳性率，提示理气活血滴丸对ISO诱导慢性心力衰竭大鼠左心室功能的改善作用，与其抑制心肌细胞凋亡有关，进而使理气活血滴丸对大鼠慢性心力衰竭发挥保护作用。以往研究表明细胞凋亡主要有两种途径：外源性或死亡受体途径和内在或线粒体途径[18-19]，下一步课题组将对此展开深入研究。

综上所述，理气活血滴丸对ISO诱导的慢性心力衰竭大鼠具有保护作用，该保护作用与其能显著改善CHF大鼠左心室功能，抑制心肌细胞凋亡作用有关。