妇女痛经颗粒中丹参酮ⅡA的含量测定

2018-11-02丁叶孙茜

江西化工 2018年5期

丁叶孙茜

(上海市宝山区仁和医院，上海 200431)

妇女痛经颗粒是由延胡索(醋制)、五灵脂(醋炒)、丹参及蒲黄(炭)四味药加工制成的颗粒剂，收载于《国家食品药品监督管理局国家药品标准·新药转正标准》第80册，具有活血、调经、止痛之功效，主治气血凝滞，小腹胀痛，经期腹痛等症状[1]。丹参是方中主药之一，为唇形科植物丹参的干燥根及根茎，具有祛瘀止痛、活血通经之功效，可用于月经不调，经闭痛经等[2-3]。丹参的化学成分主要分为两类，脂溶性的二萜醌类和水溶性的酚酸类，其中丹参酮ⅡA是最主要的脂溶性成分[4-7]，具有扩张血管，改善微循环，抗动脉粥样硬化[8]，减轻缺氧引起的心肌损伤，促进心肌再生[9]，抑制血小板凝集，降低全血和血浆粘度[10]等药理作用。妇女痛经颗粒现行标准以延胡索中延胡索乙素为含量测定指标，质量考察指标不够充分[1-2]。根据药品标准提高要求，考察了丹参中丹参酮ⅡA的高效液相色谱法[2，11-13]。通过实验，建立了丹参中丹参酮ⅡA的含量测定方法，该方法简便易行，用时短，操作误差小，为妇女痛经颗粒的质量控制提供了更有效的方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与材料

仪器：Agilent1200高效液相色谱仪，Agilent1200DAD二极管阵列检测器，Agilent Technologies；AE-240电子天平，AEG220电子天平，日本岛津公司；HN1OO6B超声仪，广州华南超声仪器厂；TGL-16G离心机，上海安亭科学仪器厂；Millipore-Q Gradient 超纯水装置，美国Millipore公司。

丹参酮ⅡA对照品，由中国药品生物制品检验所提供，批号：110766-200518；甲醇为色谱纯，水为Millipore装置制备的超纯水；其他试剂均为分析纯。样品由山东绿因药业有限公司提供。

1.2 对照品溶液的配制

精密称取丹参酮ⅡA对照品15.32mg，用甲醇溶解并定容到100mL容量瓶中，即得浓度为0.15mg·mL-1的对照品溶液。分别精密量取0.4、0.8、2、5、20和50mL对照品溶液置于100mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得丹参酮ⅡA对照溶液系列浓度溶液。

1.3 供试品和阴性溶液的制备

供试品溶液的制备：取样品，研细，取约0.25g，精密称定，置25ml量瓶中，加入甲醇适量，超声处理(功率250W，频率33kHz)30分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，即得。

阴性样品溶液的制备：取缺丹参阴性样品约0.25g，同法制成阴性样品溶液。

1.4 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-水(75：25)；流速：1.0ml·min-1，进样量10μl；检测波长为270nm；柱温：35℃。

2 结果与讨论

2.1 系统适用性试验及专属性考察

按1.4项下色谱条件，将对照品溶液，供试品溶液及阴性样品溶液注入液相色谱仪，各10μl，记录色谱图(见图1、2、3)。在此色谱条件下，丹参酮ⅡA的保留时间为25.46min，且对照品溶液色谱图在与供试品溶液色谱图相同的位置处有吸收峰，而阴性样品色谱图在此位置无吸收峰，表明供试品中其他成分对丹参酮ⅡA含量测定无影响。

图1 对照品HPLC图

图2 供试品HPLC图

图3 阴性HPLC图

2.2 线性关系的考察

按1.4项下色谱条件将对照品系列浓度溶液注入色谱仪，各10μl记录色谱图。以对照品的质量浓度(μg·mL-1)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线得到回归方程为：

Y=49.34X+0.067(R2=0.9999)，表明丹参酮ⅡA的质量浓度在0.6128～76.6μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.3 检测限和定量限

降低对照品溶液的浓度，使丹参酮ⅡA峰面积减少，峰高降低至信噪比(S/N)的10倍为界限时，仪器可检测到丹参酮ⅡA的最低含量为0.061μg·mL-1，峰高降低至信噪比(S/N)的3倍为界限时，仪器可检测到丹参酮ⅡA的最低含量为0.019μg·mL-1。

2.4 精密度试验

在1.4项色谱条件下取10μL供试品溶液注入色谱仪，重复进样6次，记录峰面积，以峰面积计算RSD=0.34%(n=6)，表明本实验精密度良好。

2.5 稳定性的考察

取同一批样品(批号110402)，在配制后0、3、9、12、15、18、24h进样10μL，按1.4项下的色谱条件下进样测定，记录峰面积，以峰面积计算RSD=0.17%。表明供试品溶液在24小时内样品溶液稳定。

2.6 重复性试验

取同一批样品(批号110402)，研细，取样量0.50g，精密称定，共6份，按1.4项的色谱条件下进行测定，结果RSD=1.31%(n=6)，表明该HPLC法有良好的重现性。

2.7 加样回收试验

精密称取已知含量的样品(批号110402，丹参酮ⅡA含量为0.57mg/g)研细，取约0.25g，共9份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入丹参酮ⅡA对照品溶液(C=0.1532mg/ml)1ml，置25ml量瓶中，按供试品制备方法处理，进样10μL，测定。结果丹参酮ⅡA平均回收率(n=9)97.6%，RSD=1.25%，表明本实验方法具有较高的加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果

2.8 范围

取同一批样品(批号110402)6份，其中3份约为规定取样量的50%，另3份约为规定取样量的200%，精密称取，按1.4项的色谱条件下测定丹参酮ⅡA的含量。试验表明在规定取样量的50%至200%之间，该方法能满足测定需要。

2.9 样品含量测定

分别精密称取7批样品各0.5g，按照1.3项制备供试品溶液，再按1.4项色谱条件下各取10μL注入色谱仪，记录峰面积，并计算样品含量。结果见表2。

表2 供试品中丹参酮ⅡA含量测定结果表(n=2)

2.10 讨论

取妇女调经颗粒0.25g 2份，分别超声处理与加热回流提取30min，其他步骤同1.3项下供试品溶液制备方法，制得样品溶液，然后分别按1.4项下的色谱条件测定其峰面积，结果加热回流与超声处理提取峰面积相差不大，加热回流还会造成提取杂质过多，在丹参酮ⅡA出峰处干扰测定。故选择超声处理供试品。

取妇女调经颗粒0.25g 3份，分别超声(功率250W，频率33kHz)处理15、30、45min，其他步骤同1.3项下供试品溶液制备方法，制得样品溶液，然后分别按1.4项下的色谱条件测定其峰面积，结果提取15min时丹参酮ⅡA含量较小，提取30和45min时丹参酮ⅡA的含量相近，说明30min时可基本提取完全，故选择30min。

取样品溶液，分别以乙腈-水，甲醇-水(其组成均为75：25)为流动相，流速均为1.0 mL·min-1，结果表明：甲醇-水(75：25)分离效果好且分析时间适中。进一步考察了流速为(1.2、1.0、0.8)mL·min-1时妇女痛经颗粒的分离情况，结果表明流速为1.0mL/min时，效果最好。