正交实验优化沙棘果渣黄酮提取工艺及其抗氧化活性研究

李鹏

甘肃工业职业技术学院化工学院 甘肃天水 741025

沙棘（Hippopphae rhamnoides L.）为胡颓子科沙棘属落叶灌木或小乔木，在我国分布广泛[1]。沙棘黄酮是沙棘主要药用成分[2]，广泛存在于沙棘果、叶、茎、根等不同器官中，具有清除超氧阴离子自由基及羟自由基、防癌抗癌[3]等作用，目前，沙棘加工企业在加工沙棘浓缩汁、沙棘果酱、沙棘油等产品，产生大量的沙棘果渣，而且研究表明沙棘果渣中黄酮的含量也相当高[4]，若将沙棘果渣中黄酮提取并进行体外抗氧化活性研究，以期为开发新的天然抗氧化剂和合理利用沙棘资源提供科学依据，对延伸沙棘加工产业链，提升沙棘开发利用的经济价值具有积极意义。

本研究利用甘肃天水地区沙棘果渣下脚料为原料，通过单因素及正交试验方法对沙棘果渣黄酮进行提取工艺优化，以确定最佳的工艺条件。同时，以VC为对照，对沙棘果渣黄酮提取液对羟自由基和超氧阴离子自由基清除效果进行测定，评价其体外抗氧化活性的强弱。

1.材料与方法

1.1 仪器

紫外分光光度计；旋转蒸发器；恒温水浴锅；数控超声波清洗器；酒精计；电子天平；高速台式离心机；数显恒温水浴锅；电热恒温鼓风干燥箱。

1.2 材料与试剂 沙棘果渣（昌盛食品有限责任公司提供）。

1.3 方法

1.3.1 沙棘果渣黄酮的提取

取沙棘果渣2g，精密称定，加入体积分数为60% 的乙醇30mL，60%功率超声和一定时间提取类黄酮。提取液在20 ℃条件下8 000×g离心10 min，滤渣以同样条件提取、离心、合并上清液，然后用乙醇溶液定容为100m L。

1.3.2 沙棘汁制备

总黄酮的测定方法

采用硝酸铝络合分光光度法测定黄酮含量[5]。

取沙棘果渣提取液1 m L，置于25 m L量瓶中，测定吸光度，根据标准曲线方程计算质量浓度，由质量浓度计算沙棘果渣总黄酮提取率（%），按下式计算总黄酮提取率（%）。每个实验在相同条件下提取3 个平行样。

1.3.3 单因素实验

乙醇体积分数为30%、40%、50%、60%、70%和80%共6个水平；料液比（g·mL-1）为l∶20、1∶30、l∶40、1∶50、1∶60和1∶70共6个水平；超声波（超声功率250 W)浸提时间为10、30、50、70、90 和110 min共6 个水平；提取次数为1、2、3 次和4次共4个水平，以沙棘果渣干粉为原料，分别进行单因素试验。

例如在教学《中国石拱桥》时，为了让学生了解中国桥梁建设的光辉成就，在教学时，我们可以组织学生在阅读文本后回答下面几个问题，如：

1.3.4 正交实验设计分析

在单因素试验的基础上，选择乙醇体积分数、料液比、浸提时间、提取次数，分别设计3个水平，以沙棘果渣为原料进行正交试验，每个试验重复3次，确定沙棘果渣黄酮提取的最佳工艺条件。

1.3.5 沙棘果渣黄酮对羟自由基清除率的测定

将沙棘果渣黄酮提取液依次按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20 和 1∶25 稀释，得到不同质量浓度的样品醇溶物。精确吸取3 m L不同质量浓度（0.509、0.768、0.914、1.691、3.318 mg·L-1 ）样品醇溶物于试管中，依次向试管中加入2 m L 0.1 mol·L-1 FeSO4、2 m L 0.1 mol·L-1水杨酸、2 m L 0.1 mol·L-1 H2O2，用蒸馏水定容至10 m L并摇匀，在37 ℃条件下恒温加热30 min后在510 nm波长处测定其吸光度Aa；将体系中样品用3 m L无水乙醇代替，在相同条件下测定其吸光度A0；将体系中H2O2用蒸馏水代替在相同条件下测定其吸光度Ab。用等质量浓度的VC代替样品做对照，按下式计算清除率（E）：

1.3.6 沙棘果渣黄酮对超氧阴离子自由基清除率的测定

取5支10 m L离心管各加入pH 8.2的50 m mol/L Tris-HC1缓冲液4.5 m L，再分别加入果渣提取液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 m L，然后依次加蒸馏水0.8、0.6、0.4、0.2、0.0 m L，混匀后在25 ℃恒温水浴中保温20 min，取出后立即加入在25 ℃预热过的3 mmol/L邻苯三酚溶液0.3 m L启动反应。5 min后加10 mol/L盐酸溶液0.2 m L终止反应。同时另取5支离心管，按上述步骤依次加入Tris-HCl缓冲液、黄酮提取液和蒸馏水，然后分别加10 m mol/L盐酸溶液0.3 m L，5 min后加10 mol/L盐酸溶液0.2 m L终止反应，摇匀。在325 nm波长处检测吸光度。按照下式计算沙棘果渣黄酮提取液对超氧阴离子自由基的清除率：

其中：A1为不含样品的吸光度；A2为不含样品和邻苯三酚的吸光度；A3为含样品的吸光度；A4为含样品，但不含邻苯三酚的吸光度。

2 结果与分析

2.1单因素实验设计分析

实验结果表明，沙棘果渣黄酮提取量随着乙醇体积分数的增加而增加，当乙醇体积分数为60%时达到最大，当乙醇体积分数增加到60%之后，沙棘果渣总黄酮提取量有所下降，在正交试验中应选择50%～70%的乙醇作为优化的参考范围。

沙棘果渣黄酮提取量随着料液比的增加而增加，料液比为1:20时达到最大值，当料液比增加到1:40之后，其增加量对黄酮提取量的影响不大，料液比越大,溶剂用量越大，有利于黄酮的溶出，但当达到最大的溶解度后黄酮类化合物基本提取完全，黄酮提取量不再增加，继续增加料液比会造成溶剂和能源的浪费，因此在进行正交试验时，选择1:20～1:40进行优化。

随着提取时间的延长，黄酮提取率逐渐增加，且增幅明显。当浸提时间为50 min时，继续延长浸提时间，提取率以较小的平缓幅度增加，考虑到浸提时间越长，能耗及经济成本越大，因此在进行正交试验时，选择50～90 min进行优化。

沙棘果渣黄酮提取量随着提取次数的增多而增加，提取次数为4次时达到最大值，当提取次数为3次之后，沙棘果渣黄酮提取量缓慢增加，但对提取量的影响不大。

2.2 正交实验设计分析

选取乙醇体积分数、料液比、提取时间和提取次数进行正交实验设计。按照 4因素 3 水平正交实验进行 9 次实验，每次实验平行3次。正交实验分析结果见表1。

表1 沙棘果渣黄酮提取正交试验结果与分析

由表1可知，沙棘果渣黄酮提取的最佳配比组合A1B3C3D3，即乙醇体积分数60%，料液比(1:40)，提取时间为90 min，提取次数为3次。极差分析表明，提取次数对沙棘果渣黄酮提取的影响最大，各因素对沙棘酸奶感官品质影响主次为提取次数＞乙醇体积分数60%＞料液比＞提取时间。

2.3 沙棘果渣黄酮提取液抗氧化活性

2.3.1 沙棘果渣黄酮提取液清除羟自由基能力分析

图1 沙棘果渣黄酮提取液和VC对羟自由基的清除能力

结果表明，沙棘果渣黄酮提取液和VC清除羟自由基的能力与质量浓度呈上升趋势，黄酮提取液和VC对羟自由基的清除率分别为41.37%～43.52%和36.95%～39.10%。沙棘果渣黄酮提取液质量浓度为3.318 mg·L-1时，清除率达到43.52%，明显大于同等质量浓度VC的清除率39.10%。

2.3.2 沙棘果渣黄酮提取液清除超氧阴离子自由基能力分析

图2 沙棘果渣黄酮提取液和VC对超氧阴离子自由基的清除能力

结果表明，沙棘果渣黄酮提取液和VC清除羟自由基的能力与质量浓度呈上升趋势。黄酮提取液和VC对超氧阴离子自由基的清除率分别为46.89%～58.75%和63.26%～85.67%，说明沙棘果渣黄酮提取液对超氧阴离子自由基有抑制作用，沙棘果渣黄酮提取液对超氧阴离子自由基的清除率明显小于同等质量浓度VC。同时，沙棘果渣黄酮提取液对超氧阴离子自由基的清除能力明显大于对羟自由基的清除能力。

3.结论

采用超声波辅助提取法对甘肃天水地区沙棘果渣黄酮进行了提取，通过单因素试验和正交试验，得到影响黄酮提取率的提取因素的影响力大小为：提取次数＞乙醇体积分数＞提取时间＞料液比。通过单因素试验和正交试验对沙棘果渣黄酮超声辅助提取工艺进行优化，得到最佳提取条件为料液比为乙醇体积分数为50%，提取时间为90 min和，料液比为1:40，提取3次，在此优化条件下，沙棘果渣总黄酮含量为3.157%。

通过自由基清除率测定实验，表明沙棘果渣黄酮类化合物对生物体内常见的2 种氧自由基都具有一定的清除作用，随着黄酮质量浓度的增大，对自由基的清除能力也增强。研究结果还表明其对超氧阴离子自由基的清除作用强于对羟自由基的清除作用，这和已有的研究结果基本一致[9]。因此，甘肃天水地区沙棘果渣在抗氧化剂和功能食品的开发方面有良好的应用前景，这将为利用沙棘进行工业化生产黄酮类化合物提供理论依据。