绞股蓝水提醇沉液抗川楝子致小鼠慢性肝损伤的实验研究

彭心怡 倪锴文 丁阳阳 金红婷 王 萍

川楝子是楝科植物川楝（Melia toosendan Sieb.et Zucc.）的干燥成熟果实，有小毒，归肝、小肠、膀胱经。2010年版《中国药典》中记载川楝子是一味广泛应用于肝郁化火，胸胁、脘腹胀痛，疝气疼痛及虫积疼痛的药物，但因其毒性，尤其对肝、肾等器官影响较大[1-2]，故不可久用。绞股蓝，葫芦科绞股蓝属植物绞股蓝 （Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino）的干燥根茎或全草，其有效成分绞股蓝皂苷多作为护肝药物用于降低血脂[3]、治疗脂肪肝[4]。目前对于川楝子肝毒性的研究较多集中于急性损伤[5-8]。有研究[6-10]表明，通过白芍、小茴香、延胡索等中药配伍后可减少川楝子肝毒性。而关于川楝子长期用药，长期与其他中药配伍对肝脏损伤的研究报道则较少[8，10]。同时绞股蓝对川楝子肝毒性的减毒作用及其机制的研究未见报道[11]。本文探讨单用川楝子与川楝子、绞股蓝合用18天对小鼠肝脏的影响及作用机制。

1 材料

1.1 实验动物 清洁级，ICR小鼠28只，雌雄各半，体质量15～20g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物合格证号：SCXK（沪）2012-0002。饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心。

1.2 试剂与仪器 川楝子（批号170603）、绞股蓝（批号170601），购于浙江中医药大学名中医馆。谷丙转氨酶（ALT）试剂盒（批号 07495/00003783）、谷草转氨酶（AST）试剂盒（批号 07481/00003747），购于德赛（Diasys Diagnotics Systems GmbH）公司。超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（批号20170519）、丙二醛（MDA）试剂盒（批号20170418）、考马斯亮兰试剂盒（批号20171228），均购于南京建成生物工程研究所。HITACHI7020自动生化分析仪，日立株式会社；Varioskan Flash酶标分析仪，赛默飞世尔科技有限公司。

2 方法

2.1 药物制备方法 川楝子水提醇沉液：将川楝子粉碎至颗粒状，以1:10比例加入超纯水，煮沸后以文火煮30min，水煎2次，合并过滤液，3000r离心，加入分析级无水乙醇，配制至乙醇浓度为70%，4°C冰箱放置过夜，滤去絮状沉淀，回收乙醇，将上述水提醇沉液浓缩至生药含量10g/mL，置4°C冰箱避光保存备用。川楝子绞股蓝水提醇沉液（以下简称川绞水提醇沉液）中川楝子与绞股蓝配比为8：2，其余均同前。临用前，用蒸馏水分别配置成所需浓度的溶液。

2.2 分组及给药方法 28只ICR小鼠随机分为正常组8只，川楝子组10只，川楝子绞股蓝组（川绞组）10只，每组雌雄各半。小鼠在适应性饲养7天后，开始给药，川楝子组予川楝子（生药）100g/kg；川绞组予125g/kg，其中川楝子含量100g/kg、绞股蓝含量25g/kg灌胃。各组按0.2mL/10g灌胃给药。正常组给予等容积的蒸馏水。

2.3 指标取材及检测方法 给药18天后，禁食不禁水24h，第19天，称取体质量，眼球静脉丛取血，采用全自动生化分析仪测定血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）；颈椎脱臼法处死小鼠，摘除肝脏计算肝脏指数（肝脏重/体质量×100%），取部分肝组织用0.9%NaCl溶液制成10%肝匀浆，采用黄嘌呤氧化酶法测试超氧化物歧化酶（SOD）活力、采用TBA法测量丙二醛（MDA）含量。

2.4 慢性肝损伤模型 目前临床上川楝子致急性肝损伤实验多用灌胃给药2h后进行取血、摘除肝脏检测的方法[8]，而给小鼠灌胃并于24h后进行肝功能等检测[9]观察长期肝毒性和慢性肝损伤[7，12-13]。故本实验按川楝子（生药）100g/kg剂量灌胃18天，制造慢性肝损伤小鼠模型。

2.5 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行统计处理，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用成组t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

实验第9天，因灌胃失误，川绞组小鼠死亡1只。

3.1 各组小鼠血清ALT、AST及肝脏指数比较 与正常组比较，川楝子组小鼠血清ALT值无明显变化，AST值上升（P＜0.05），肝脏指数增高不明显。与川楝子组比较，川绞组ALT值、肝指数无明差异，AST有下降趋势，但差异无统计学意义，与正常组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。故在连续给药18天后，川楝子组存在一定肝毒性，川绞组显示有降低该毒性的趋势。见表1。

3.2 各组小鼠肝组织SOD活性、MDA含量比较 与正常组比较，川楝子组小鼠肝组织MDA含量明显下降（P＜0.01），SOD 活性变化不明显，SOD/MDA 显著

表1 各组小鼠血清ALT、AST及肝脏指数比较（±s）

表1 各组小鼠血清ALT、AST及肝脏指数比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；ALT：谷丙转氨酶；AST：谷草转氨酶

组别正常组川楝子组川绞组鼠数8 10 9 ALT（IU/L）40.60±10.16 42.26±11.07 44.13±6.71 AST（IU/L）120.00±35.05 169.78±55.65*155.17±33.97肝指数（%）4.87±0.46 4.89±0.53 4.93±0.29

升高（P＜0.01）；川绞组小鼠肝组织MDA含量较正常组明显下降（P＜0.01），SOD活性变化不明显，SOD/MDA 高于正常组（P＜0.05），低于川楝子组（P＜0.05）。见表2。

表2 各组小鼠肝组织SOD活性、MDA含量比较（x±s）

4 讨论

单次灌服一定剂量川楝子对小鼠有急性肝毒性，且毒性有时效与量效关系[1，14]，目前发现该损伤机制主要与肝细胞损伤、脂质过氧化、炎症反应、线粒体功能等失常有关[5-6]，而通过与其他中药配伍[10]后可减少肝毒性。绞股蓝，主要有效成分为绞股蓝皂苷、绞股蓝多糖，在连续给药后起一定保肝作用，有抑制氧化应激，减少脂质过氧化与自由基生成[15-16]、抑制炎症反应[17]、抑制线粒体通路介导的肝细胞凋亡[11]等药理活性。故根据川楝子损肝机制与绞股蓝保肝机制，推测两药存在配伍解毒的可能性。

本实验结果显示，川绞组AST值与正常组相比无统计学意义（P＞0.05），并且较川楝子组结果有降低趋势，故可能存在抗川楝子致肝损伤作用。川楝子组的AST值显著上升，ALT值未上升，该结果与齐双岩[13]长期用药实验结果不同。但在毒性时效性研究中有报导称，川楝子肝毒性出现早、持续时间短暂，给药24h后ALT值可有恢复正常的情况[1]，也有给药持续时间长，转氨酶进行性消耗，出现适应性肝损伤现象的报导[7]。在利福平建立的慢性肝损伤模型中，用药14天后ALT也未出现统计学差异[18]，故考虑ALT值未上升是川楝子久用发生了适应性肝损伤的结果。由于川楝子造成的肝损伤属于化学性肝损伤，所以本实验通过检测SOD活性与MDA含量，了解长期用川楝子与川楝子绞股蓝对肝脏在氧化应激、脂质过氧化方面的影响。SOD催化超氧阴离子自由基还原为过氧化氢，其活力越高，反映肝脏组织清除氧自由基的能力越强[19]，本实验中三组并无明显差异（P＞0.05），提示川楝子组、川绞组并不影响肝细胞SOD活力。MDA作为膜脂过氧化重要产物，含量越高，则间接反映肝脏细胞受氧自由基攻击的程度越严重；SOD与MDA的比值可用于反映肝组织脂质过氧化的程度，比值越高氧化程度越小[8，20]。本研究结果显示，川楝子组与川绞组MDA含量均下降（P＜0.01），SOD/MDA 比值上升（P＜0.05，P＜0.01），尤其是川楝子组结果与之前文献报导结果相反，提示川楝子提取液可能影响肝细胞内MDA的生成，或者川楝子不以氧化应激途径损伤肝细胞，或是连续给药可抑制细胞内脂质过氧化。在氯丙烯的毒理研究中也出现SOD活性下降然而MDA提示过氧化程度降低的结果[21]，故长期用川楝子可能并不能使MDA含量增多。近年研究[22]发现，MDA在体内可能存在双重角色，并非只提示过氧化程度，有实验[23]发现适当高剂量MDA可促进葡萄糖刺激胰岛素分泌作用，升高ATP/ADP比率等，所以该组实验结果及意义仍需进一步验证探讨。本研究显示，川绞组与正常组相比MDA含量下降显著（P＜0.01），与川楝子组相比含量上升（P＜0.05），提示绞股蓝与川楝子在脂质过氧化中存在对抗作用，但仍可降低过氧化产物含量，且川绞组ALT值、AST值与正常组相比无差别（P＞0.05），所以认为川楝子与绞股蓝合用可缓解其对肝脏造成的损伤。

川楝子性苦味寒，有疏肝泄热、行气止痛、杀虫的功效。绞股蓝性凉味甘苦，具益气健脾、化痰止咳、清热解毒的功效。而两药性寒凉，味苦，性味上不存在阴阳明显对立的情况，川楝子疏肝与绞股蓝健脾配伍，即使长时间运用川楝子疏肝泄热也不至伤脾胃，故临床存在配伍的可能性。