一种从杜仲翅果中快速提取杜仲橡胶的方法

杨 洪，候岚菲，林奕冬，陈露露，2，代龙军，王笛菲，向 贤，2，邓 治，杜红岩，李德军*

(1.农业农村部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室，省部共建国家重点实验室培育基地-海南省热带作物栽培生理学重点实验室，海南省热带作物栽培生理学重点实验室，中国热带农业科学院橡胶研究所，海南儋州571737；2.海南大学热带农林学院，海南海口570228；3.国家林业局泡桐研究开发中心，中国林业科学研究院经济林研究开发中心，河南郑州 450003)

杜仲(Eucommiaulmoides)为杜仲科植物，是我国特有的名贵药材和木本油料植物。杜仲浑身都是宝，皮、花、果、叶等具有很高的食用和药用价值。杜仲富含绿原酸、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖甙、氨基酸、环烯醚萜、黄酮及微量元素等活性成分，具有抗氧化、降血压、降血脂、抗菌消炎、安胎、利尿、免疫调节等作用[1-3]。目前，杜仲籽油和杜仲雄花作为新资源食品原料获得国家批准，杜仲叶也通过药食同源专家评审。此外，以杜仲叶为原料的功能饲料能增加畜禽体内胶原蛋白含量，减少中性脂肪和胆固醇含量，提高畜禽免疫力[4-5]。

杜仲是仅次于巴西橡胶树的优质胶源树种。杜仲适生区域分布在全国 27 个省(区、市)，而我国巴西橡胶树的种植区域主要分布在海南、云南、广东等地，在地理分布上与巴西橡胶树相比具有明显优势。杜仲根、茎、叶、果皮等部位均含有杜仲橡胶，其中果皮的含胶量最高达15%～18%[6]。杜仲橡胶(E.ulmoidesrubber，EUR)与天然橡胶(产自巴西橡胶树)均为聚异戊二烯，但是天然橡胶为顺式-聚异戊二烯，常温下为柔软的弹性体，而杜仲橡胶为反式-聚异戊二烯，常温下易结晶。将杜仲橡胶和天然橡胶按一定比例共混能够提升复合材料的理化特性，可以满足仿生医学、工程机械等高端领域的应用需求[7]。

杜仲橡胶以丝状固态存在于含胶细胞中，因此不能像天然橡胶那样通过割胶收集而需要通过多步提取工艺获取。杜仲橡胶的提取可以分为三大步骤：细胞壁破除、杜仲橡胶提取、杜仲橡胶的分离纯化。目前，杜仲橡胶的提取主要有化学溶剂法、微生物发酵法和生物酶解法[8-13]。然而，这些提取方法都存在溶剂消耗多、成本高、步骤繁琐、耗时长等问题。该研究以杜仲翅果为原料，通过碱液水解获得杜仲粗胶，再以4种有机溶剂为萃取溶剂常温下浸提，可在实验室小量快速提取杜仲橡胶，以满足研究用胶需求。

1 材料与方法

1.1试验材料

1.1.1原料。杜仲翅果由中国林业科学研究院经济林研究开发中心提供。

1.1.2仪器。电子天平BSA224S(德国赛多利斯)；台式离心机(Thermo Scientific)；ZNCL-GS油浴锅(河南爱博特科技发展有限公司)；索氏提取器(规格为 500 mL)；其他常用玻璃仪器均为天津市天科玻璃仪器制造有限公司产品。

1.1.3试剂。石油醚(沸程60～90 ℃)、苯、甲醇、四氯化碳、环己烷、溴水、氢氧化钠等为广州化学试剂厂生产的分析纯试剂。

1.2试验方法

1.2.1碱浸法提取杜仲粗胶[14]。取100 g杜仲翅果，碾压、脱壳去除果仁后用5% 氢氧化钠水溶液90 ℃浸提3 h，充分分解纤维素、木质素等非胶物质。所得的溶液过滤后，用去离子水将滤渣冲洗至中性后烘干即为杜仲粗胶。

1.2.2杜仲精胶快速提取。分别以石油醚、环己烷、苯、四氯化碳4种有机溶剂为萃取溶剂，采用室温浸提法从杜仲粗胶中快速提取杜仲精胶。称取约2 g杜仲粗胶，在洁净三角瓶中用40 mL有机溶剂萃取1～3次，5 000 r/min离心5 min分离有机相，得到含胶溶液；向含胶溶液中加入40%(V/V)体积的甲醇析胶，得到的杜仲橡胶用不锈钢筛过滤，烘干后称重。

1.2.3索式抽提杜仲橡胶[14-15]。称取约2 g杜仲粗胶，分别加入石油醚和环己烷回流抽提，85 ℃(石油醚)和125 ℃(环己烷)抽提36 h，所得含胶溶液用40%(V/V)体积的甲醇析出杜仲胶，沉淀用不锈钢筛过滤，干燥后得到杜仲精胶。

1.2.4杜仲橡胶提取得率计算。杜仲橡胶得率计算方法如下：

X=M1/M0×100%

(1)

式中，X为杜仲橡胶提取得率(%)；M1为提取精制后的杜仲橡胶质量(g)；M0为杜仲粗胶的质量(g)。

1.2.5杜仲橡胶的鉴别。杜仲橡胶采用韦氏法[16]进行鉴别。精确称取约0.100 0 g待测杜仲胶块，剪碎后放入带盖坩埚中，向坩埚中滴加数滴四氯化碳后静置使其充分溶胀，滴加4～6滴溴水，再用2 g苯酚覆盖试样。然后将坩埚置于沸水浴加热5 min，以加快反应速度，并使四氯化碳完全挥发。若产物呈现蓝色或蓝紫色，则表明该试样是杜仲橡胶。应用该方法鉴定杜仲橡胶，反应现象明显，反应迅速，灵敏度高。

1.2.6杜仲橡胶纯度测定。杜仲橡胶纯度采用天然生胶杂质含量测定国家标准(GB/T 8086—2008)进行测定。将试样剪成宽 5 mm 的细条状，放入干燥洁净的250 mL三角瓶中，加入含 150 mL橡胶溶剂(0.25% 2-硫醇基苯并噻唑)，125～130 ℃油浴加热使之充分溶解。然后趁热用已称重的孔径为 45 μm 的洁净不锈钢筛过滤。用预热的橡胶溶剂反复冲洗不锈钢筛3～5次，以保证无胶残留在钢筛上。含有杂质的钢筛在石油醚中浸泡15～20 min后取出沥干，于烘箱中烘至恒重。杜仲胶纯度计算方法为：

A=1-(W2-W1)/W0×100%

(2)

式中，A为纯度(%)，W0为测试样品重量(g)，W1为不锈钢筛重量(g)，W2为杂质和不锈钢筛重量(g)。

1.2.7提取效率计算。索式抽提法是实验室提取杜仲橡胶的经典方法，因此以索式抽提法为参照计算不同萃取溶剂常温快速提取杜仲橡胶的提取效率。提取效率计算方法如下：

η=(A1×X1/A2×X2)×100%

(3)

式中，η为提取效率，A1和X1分别为某种萃取溶剂三次提取所得杜仲橡胶的纯度和得率的平均值，A2和X2分别为索式抽提法使用该种溶剂3次提取所得杜仲橡胶的纯度和提取得率的平均值。

2 结果与分析

2.1杜仲粗胶的制备将杜仲翅果进行碾压、脱壳，除去不含胶的果仁。此时，杜仲翅果被碾压成片状但杜仲胶没有暴露(图1a)。为使杜仲翅果中的杜仲胶充分暴露，采用碱浸法提取杜仲粗胶。经5%氢氧化钠溶液90 ℃浸提3 h，所得溶液过滤后将滤渣用去离子水冲洗至中性，55 ℃烘干得到白色絮状的杜仲粗胶(图1b)。

注：a.杜仲翅果；b.杜仲粗胶Note：a.E.ulmoides key-fruits；b.Crude EUR图1 杜仲翅果和杜仲粗胶Fig.1 E.ulmoides key-fruits and crude EUR

2.2杜仲精胶快速提取分别以苯、环己烷、石油醚、四氯化碳为萃取溶剂，采用室温浸提法从杜仲粗胶中萃取杜仲胶，通过短时低速离心可将含胶有机相和杂质分离，得到杜仲精胶。利用韦氏鉴别法，4种萃取溶剂提取到的杜仲橡胶反应后均呈蓝色，说明4种有机溶剂都能从杜仲橡胶粗胶样品中萃取杜仲橡胶，均可作为杜仲粗胶室温浸提法的萃取溶剂。以苯和石油醚为萃取溶剂提取的杜仲橡胶晾干后呈薄片状，略带有灰色杂质(图2a和2b)。环己烷为萃取溶剂提取到的杜仲橡胶呈薄膜状，带有黄色色素污染(图2c)。四氯化碳为萃取溶剂提取到的杜仲橡胶呈较深的棕色(图2d)。经得率和纯度测定，4种萃取溶剂所得的杜仲橡胶得率和纯度从高到低依次为石油醚、环己烷、苯和四氯化碳(图3和表1)。

注：a.苯提取到的杜仲精胶；b.石油醚提取到的杜仲精胶；c.环己烷提取到的杜仲精胶；d.四氯化碳提取到的杜仲橡胶Note：a.High-quality EUR extracted with benzene；b.High-quality EUR extracted with petroleum ether；c.High-quality EUR extracted with cyclohexane；d.EUR extracted with carbon tetrachloride图2 4种不同萃取溶剂提取到的杜仲精胶Fig.2 High-quality EUR extracted with four different organic solvents

图3 4种有机萃取溶剂提取的杜仲橡胶得率和纯度Fig.3 The purity and yield of the EUR extracted with four different organic solvents

萃取溶剂Organic solvents样品Sampleg胶重Weights of EURg得率Yield%纯度Purity%苯Benzene2.009 70.552 827.5190.67环己烷Cyclohexane2.017 20.570 428.2891.59石油醚Petroleum ether2.024 20.642 331.7392.69四氯化碳Carbon tetra-chloride2.013 50.526 226.1383.83

注：所列数据为3次测定的平均值

Note：The values listed represent the average of three replicates

2.3索式抽提法提取杜仲精胶为比较4种不同有机萃取溶剂从杜仲粗胶中萃取杜仲橡胶精胶的效率，选择得率和所得杜仲橡胶纯度较高的石油醚和环己烷为回流溶剂进行索式回流抽提。称取2 g左右杜仲粗胶，加入石油醚或环己烷分别进行回流抽提。分别在85 ℃(石油醚)和125 ℃(环己烷)下回流抽提36 h。以石油醚为回流溶剂抽提得到的杜仲橡胶呈白色(图4a)，而以环己烷为回流溶剂抽提得到的杜仲橡胶略带黄色(图4b)。从表2和图5可以看出，用石油醚回流抽提得率和纯度均高于环己烷抽提。因此，该研究提取效率的计算以石油醚为回流溶剂的索式抽提法作为参照。

注：a.石油醚提取杜仲精胶；b.环己烷提取杜仲精胶Note：a.EUR extracted with petroleum ether；b.EUR extracted with cyclohexane图4 索式抽提法提取到的杜仲精胶Fig.4 The EUR extracted with Soxhlet apparatus

2.4抽提效率对比从图6可以看出，室温浸提法4种不同萃取溶剂中石油醚浸提效率最高，是石油醚回流索式抽提的62.46%；其次是环己烷和苯，效率分别为55.14%和52.97%；四氯化碳浸提效率最低，仅为47.08%。

表2不同回流溶剂对索式抽提法提取杜仲精胶的影响

Table2TheeffectofdifferentsolventsonextractionofEURwithSoxhletappratus

回流溶剂Refluxing solvent样品重Weight of sampleg胶重Weight of EURg得率Yield%胶纯度Purity%石油醚Petroleum ether2.0280.99048.8196.48环己烷Cyclohexane2.0460.75436.8695.07

注：所列数据为3次测定的平均值

Note：The values listed represent the average of three replicates

图5 不同回流溶剂索式抽提的得率和胶纯度Fig.5 The purity and yield of the EUR extracted by different solvents with Soxhlet appratus

图6 4种萃取溶剂的杜仲橡胶提取效率Fig.6 The EUR extraction efficiency of the four extraction solvents

3 结论

以杜仲果为原料，用碱浸法使纤维素、木质素等非胶物质分解，再经过滤、冲洗、烘干得到杜仲粗胶。以4种有机溶剂作为萃取溶剂，采用室温浸提法对杜仲粗胶进行精提取，结果表明4种有机溶剂均能从杜仲粗胶中萃取到杜仲精胶。对得率和提取到的杜仲精胶纯度分析表明，以石油醚为萃取溶剂提取效果最佳，其次是环己烷。以石油醚回流索式抽提法为参照，4种有机溶剂快速提取杜仲精胶的效率从高到低依次为石油醚、环己烷、苯和四氯化碳。综合考虑得率、纯度和提取效率3个因素，石油醚为杜仲精胶室温浸提的最佳萃取溶剂。该方法简单易行，无需复杂的玻璃仪器。溶剂消耗少，且可以回收循环使用，具有提取周期短、对环境污染小的优点，可以用于实验室从杜仲橡胶翅果中快速提取杜仲精胶。