基于荧光共振能量转移的金纳米粒子/碳量子点荧光纳米探针检测精氨酸

邹小波 史永强 郑悦 石吉勇 胡雪桃 蒋彩萍 黄晓玮 徐艺伟

摘 要 利用碳量子点 （CQDs） 和金纳米粒子 （AuNPs）间的荧光共振能量转移（FRET） 效应成功实现了精氨酸的快速检测。采用一步微波辅助法合成具有优良荧光性能的碳量子点 （CQDs），并对AuNPs/CQDs复合材料进行相应表征，分析了其猝灭和检测机制。对AuNPs/CQDs的添加量、pH值和反应时间进行了优化。在优化条件下，将此荧光体系用于精氨酸含量的检测，结果表明，荧光强度和精氨酸浓度在0.1～10.0 μmol/L范围内呈良好的线性关系（R2=0.993），检出限为5.8 nmol/L。采用本方法测定了葡萄汁中精氨酸的含量，回收率为105.4%～110.8%，表明本方法可用于果汁中精氨酸的实际检测。

关键词 精氨酸； 荧光探针； 荧光共振能量转移； 碳量子点； 金纳米粒子

1 引 言

精氨酸是机体合成蛋白质和肌酸的重要原料，在改善繁殖能力、心血管功能以及调控免疫能力等方面发挥着重要作用[1]。而在发酵工业中，精氨酸在精氨酸酶的作用下会被降解为尿素和鸟氨酸，一部分尿素会被释放到发酵液中。如果原料含有过量的精氨酸，发酵液积累的尿素会与乙醇发生反应生成氨基甲酸乙酯 （EC），而EC对人体具有潜在的致癌作用[2]。因此，检测原材料中精氨酸含量具有重要意义。

目前，检测精氨酸的方法有坂口试剂法[3]、色谱法[4，5]、光度法[6]、电化学法[7]等。在众多检测方法中，荧光光谱法因其简单快速、灵敏度高、易于操作而受到关注。尤其是荧光共振能量转移（FRET）技术，当供体的荧光发射光谱和受体的吸收光谱存在一定重叠且距离足够近时，荧光能量会由供体向受体转移。FRET技术能够克服单一材料的缺陷，提高检测灵敏度和精度[8]，已成功应用于目标物如核酸[9，10]和离子检测[11～13]等。

荧光碳量子点（CQDs）是一种新型荧光纳米材料，因其具有发射波长可调、荧光稳定性好等优点而广泛应用于传感领域[14～17]。基于FRET效应的CQDs在荧光检测方面的应用已有很多报道[18～20]，这些研究的共同点是将CQDs作为FRET体系的能量供体。金纳米粒子（AuNPs）具有良好的生物相容性和穩定性，消光系数高，其吸收光谱在520 nm 附近有一个共振吸收峰[21]，在FRET体系中可充当能量受体。

本研究首先通过微波辅助法一步制得CQDs，合成方法简单易行， 基于CQDs与AuNPs间的FRET效应，建立了一种测定精氨酸含量的新方法，并应用于葡萄汁中精氨酸浓度的定量检测， 以期达到快速、准确检测精氨酸的目的。

2 实验方法

2.1 仪器与试剂

JEM-2100高倍透射电子显微镜（HRTEM，日本JEOL公司）； UV-1601紫外可见分光光度计（北京北分瑞利分析仪器有限公司）；Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪（美国Thermo Scientific公司）； QuantaMasterTM 40荧光寿命光谱仪（美国PTI公司）； F-98荧光分光光度计（Lengguang 科技公司）； Zetasizer粒度电位仪（英国Malvern公司）； 微波炉（美的集团）； 飞鸽TGL-15B离心机（上海安亭科学仪器厂）； Milli-Q型超纯水机（美国Millipore公司）。

聚乙二醇（PEG200，美国Sigma-Aldrich公司）； 其余试剂（氯金酸、柠檬酸三钠、蔗糖、亚硝酸钠、硫酸喹啉、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸等）均购自国药集团化学试剂有限公司； 所用试剂均为分析纯，实验用水为超纯水（18.2 MΩ cm）。

2.2 碳量子点（CQDs）的制备

参照文献[22]的方法并稍作改进合成CQDs，具体方法如下：取1 mL蔗糖溶液（30%）和200 μL浓H2SO4置于10 mL烧杯中，加入6 mL聚乙二醇200 （PEG 200），混合搅拌10 min，微波加热15 s，微波炉功率为900 W，溶液由无色变为金黄色即表示碳量子点的成功制备。将所得到的碳量子点溶液在5000 r/min下离心15 min以去除不溶物，并用透析袋（MWCO 1000，美国Thermo Fisher公司）在超纯水中透析24 h。透析结束后，用NaOH溶液调节碳量子点溶液至pH 7.0，并将所制备的碳量子点稀释至100 mL，4℃下保存，备用。

2.4 金纳米粒子的制备

参考文献[24]的方法，采用柠檬酸钠还原法制备金纳米粒子。将200 mL氯金酸（0.4 mg/mL）溶液水浴加热至沸， 迅速加入20 mL柠檬酸三钠溶液（11 mg/mL），并在磁力搅拌的作用下恒温水浴30 min， 至溶液变为橙红色。待冷却至室温，过0.2 μm滤膜，得到的AuNPs溶胶于4℃下保存，备用。

2.5 精氨酸的检测

将所制备的AuNPs溶胶（1 mL）与CQDs溶液（1 mL）进行混合，经充分搅拌后，静置10 min，形成AuNPs/CQDs溶液。将不同浓度的精氨酸溶液分别与AuNPs溶液（1 mL）或AuNPs/CQDs溶液混合，用磷酸盐缓冲液（PBS， 3%， pH=4.5）稀释至5 mL，摇匀，静置10 min。测量混合液的荧光光谱和吸收光谱，根据荧光光谱强度随精氨酸浓度变化关系建立标准曲线。

2.6 葡萄原汁中精氨酸检测

选用某葡萄酒厂压榨后的葡萄原汁为实验样品。首先在5000 r/min下离心15 min，以除去杂质，移取上清液， 备用。为了验证AuNPs/CQDs荧光传感体系用于检测葡萄汁中精氨酸含量的可行性，分别向实验样品中加入不同浓度的精氨酸溶液， 按照2.5节所述方法进行检测。

3 结果与讨论

3.1 CQDs和AuNPs/CQDs形貌及光谱表征

采用高分辨透射电子显微镜（HRTEM）对所制备量子点进行表征。由图1A可见，所制备的CQDs呈球形单分散状态，粒径约为3～5 nm； 由AuNPs的TEM图（图1B）和粒径分布图（图1C）可见，AuNPs具有较好的分散性，粒径主要分布在4.0～8.0 nm之间，平均粒径为6.2 nm。由AuNPs/CQDs的TEM图（图1D）和粒径分布图（图1F）可见，AuNPs/CQDs复合材料粒径变大，粒径主要分布在11.0～15.0 nm之间。 图1E中0.24 nm的晶格间距与Au （111）的晶面间距相符，0.21 nm的晶格间距属于石墨的（100）晶面[25]，这表明AuNPs成功修饰到了CQDs表面。

4 结 论

本研究制备的CQDs具有优良的荧光性能和稳定性，且AuNPs/CQDs材料制备方法简单易行。利用CQDs与AuNPs间的FRET效应和AuNPs与精氨酸间的团聚作用，成功实现了精氨酸浓度的定量检测。探针荧光强度与精氨酸在0.1～10.0 μmol/L浓度范围内具有良好的线性关系（R2=0.99），且检出限达到5.8 nmol/L。将本方法应用于实际葡萄汁样品中精氨酸的检测，回收率在105.4%～110.8%之间。 本研究为果汁中精氨酸的检测提供了新的解决方法。

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Abstract A novel method for rapid detection of arginine based on fluorescence resonance energy transfer effect （FRET） between carbon quantum dots （CQDs） and gold nanoparticles （AuNPs） was developed. Firstly， the CQDs with excellent fluorescence properties were synthesized by one-step microwave assisted method. The AuNPs/CQDs composites were characterized and their quenching mechanism was analyzed. Then the amount of AuNPs/CQDs， the pH value and the reaction time were optimal. Under the optimum conditions， the fluorescence system was used to detect the content of arginine， showing a good linear relationship （R2=0.993） between fluorescence intensity and concentration of arginine in the range of 0.1-10.0 μmol/L， and the detection limit was 5.8 nmol/L. Finally， the content of arginine in grape juice was determined by this method with recoveries of 105.4%-110.8%， which indicated that the proposed FRET system had the potential for practical detection of arginine in fruit juice.

Keywords Arginine； fluorescent probe； Fluorescence resonance energy transfer； Carbon quantum dots； Gold nanoparticles

（Received 5 February 2018； accepted 8 April 2018）