碳点基荧光印迹聚合物选择性检测牛血红蛋白

吕飘飘 谢丹丹 张朝晖

摘 要 以荧光碳点为载体，3-氨丙基三乙氧基硅烷为功能单体，正硅酸乙酯为交联剂，牛血红蛋白为模板分子，采用溶胶-凝胶法制备出对牛血红蛋白具有高选择性识别性能的新型荧光印迹聚合复合材料（CDs@MIP）。采用红外光谱（IR）和扫描电子显微镜（SEM）对聚合物进行表征，结果表明，分子印迹聚合物包覆在荧光碳点表面，印迹因子为4.60。此CDs@MIP对牛血紅蛋白具有高选择性，相对于卵清蛋白、牛血清蛋白、人血清蛋白的选择因子分别为4.38、4.73和3.66。在最佳条件下，此CDs@MIP对牛血红蛋白的响应线性范围为0.1～10.0 μmol/L，检出限为23.0 nmol/L。将此CDs@MIP用于牛血液样品中牛血红蛋白的测定，回收率为99.0%～102.5%。

关键词 分子印迹； 牛血红蛋白； 荧光碳点

1 引 言

分子印迹技术是在交联剂作用下使模板分子与功能单体通过共价或非共价等作用形成聚合物，脱除模板分子后在聚合物材料上留下与模板分子大小、形状和官能团都互补的三维空穴结构的新技术[1]。印迹聚合物具有稳定性高和选择识别性能高等优点[2]。荧光型分子印迹聚合物结合了荧光检测技术的高灵敏度和分子印迹聚合物的高选择性，在复杂基质中检测痕量物质展现出明显优势[3]。目前，制备荧光分子印迹聚合物主要有两种：一种是采用荧光型功能单体[4]，但这类功能单体的制备过程通常比较复杂；另一种方法是将荧光纳米粒子，如半导体量子点[5]和上转换纳米粒子[6]等包裹在分子印迹聚合物中，其制备过程相对简便。目前，荧光印迹聚合物已经成功用于检测溶菌酶[7]、四环素[8]、色氨酸[9]等，但是绝大部分研究都是采用半导体量子点为荧光源，这些基于重金属合成的半导体量子点对人和环境的毒害较大[10]。因此，探索简便、绿色的新型荧光印迹聚合物制备方法非常重要。

荧光碳点（CDs）是一种新型碳材料量子点[11～13]。相较于传统的半导体量子点和有机染料，碳点具有低毒性、生物相容性、抗光漂白性、易于合成和功能化等优点，但未经修饰的碳点通常量子产率低[14]。研究者开发了化学还原法[15]、光化学还原[16]、碳点表面钝化[17]和碳点表面修饰[18]等技术提高碳点量子点产率；而基于荧光碳点的分子印迹聚合物也已成功制备，并应用于环境污染物[19，20]、金属离子[21]、生物分子[22～25]等的检测，而关于碳点的蛋白印迹聚合物的研究还比较少。

本研究首先通过水热法合成裸CDs，然后用聚乙烯亚胺修饰CDs，通过溶胶-凝胶反应固定CDs于BHb印迹层中。制备得到的荧光印迹聚合物（CDs@MIP）结合了碳点优良的荧光性能和分子印迹技术的高选择性，为蛋白检测提供了高选择性和高灵敏度的快速检测方法。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

SIGMA HD场发射扫描电子显微镜（德国蔡司公司）；Nicolet iS10 型傅里叶变换红外光谱仪（美国尼高力公司）；F-7000荧光光谱仪 （日本日立公司）；

UV-2550紫外-可见分光光谱仪、LC2010AHT高效液相色谱（日本岛津公司）。

牛血红蛋白（BHb）、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）和人血清蛋白（HSA）购自Sigma公司；抗坏血酸（Ascorbic acid）、聚乙烯亚胺（PEI）、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）、四乙氧基硅烷（TEOS）、 Triton X-100 （Tri，纯度>99%）、氨水溶液（NH3·H2O，25%～28%， w/V）购自北京梦怡美生物科技有限公司。肝素钠抗凝牛血液购自鸿泉生物科技有限公司。其它试剂均为分析纯；实验用水为二次蒸馏水。

3.2 荧光印迹聚合物性能

3.2.1 溶液pH值影响 溶液的pH值可能会影响印迹聚合物的荧光性质和BHb的三维结构以及电荷分布，因此测定在不同pH值下CDs和CDs@MIP的荧光强度以及牛血红蛋白对CDs@MIP和CDs@NIP的猝灭效应。如图5A所示， pH值在5.0～ 8.0的范围内，CDs@MIP的荧光强度几乎不变； 当pH=9.0时，CDs@MIP的荧光强度明显降低。这是由于CDs@MIP的荧光都源于荧光碳点，而碳点的荧光在较强碱性条件下减弱[26]。如图5B所示，CDs@MIP和CDs@NIP的最大猝灭效应都发生在溶液pH=7.0时。当pH>7.5时，印迹的硅层会电离，模板蛋白和印迹位点作用力会减弱[27]。选择0.2 mol/L PBS（pH 7.0）作为最佳荧光检测条件。

4 结 论

以聚乙烯亚胺修饰后的荧光碳点为荧光源和载体，采用溶胶-凝胶法制备了高灵敏度和高选择性的荧光牛血红蛋白印迹聚合物。在优化的检测条件下，此荧光印迹聚合物成功应用于实际样品中牛血红蛋白的选择性识别和检测。本方法具有制备条件温和、过程简便、检测速度快、灵敏度高等优点，为复杂环境中蛋白快速灵敏检测提供了新方法。

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Abstract A novel fluorescent imprinted polymer （CDs@MIP） with selective recognition of hemoglobin was prepared by the

sol-gel method using fluorescent carbon dots as the carrier material， 3-aminopropyltrieth-oxysilane as the functional monomer， tetraethoxysilane as the crosslinking agent and bovine hemoglobin as template molecule. The results of IR and scanning electron microscopy showed that the molecularly imprinted polymer was coated on the surface of fluorescent carbon dots. The CDs@MIP showed selective recognition properties for bovine hemoglobin with an imprinting factor of 4.60. Also the adsorption ability and specific recognition performance of CDs@MIP were investigated， and it was found that the CDs@MIP had high selectivity toward bovine hemoglobin， and the selection factors for ovalbumin， bovine serum albumin and human serum albumin were 4.38， 4.73 and 3.66， respectively. Under the optimal conditions， the linear range of CDs@MIP for bovine hemoglobin was 0.1-10.0 μmol/L and the detection limit was 23.0 nmol/L. The CDs@MIP was successfully used for the determination of bovine hemoglobin in bovine blood samples with recoveries of 99.0%-102.5%.

Keywords Molecular imprinting； Bovine hemoglobin； Fluorescent carbon dots

（Received 13 November 2017； accepted 30 March 2018）