禽流感监测中HA和HI试验的应用

谢弘历

（江苏省无锡市锡山区安镇畜牧兽医站，江苏 无锡 214191）

禽流感（Avian Influenza，AI）是由 A型流感病毒引起的一种禽类病毒性疾病，被国际兽疫局确定为一类传染病。自1878年首次在意大利发生和流行后，140年来在世界各地多次流行，对养禽业造成重大经济损失。

某种病毒或病毒的血凝素，能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝，也称直接血凝反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验。

当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制反应，利用这种特性设计的试验称血凝抑制试验。

1 材料与仪器

1.1 病毒与血清

本文所用病毒尿囊液、血清皆由扬州大学兽医学院畜禽传染病学重点开放实验室提供。

1.2 相关试剂的配置

表1 PBS液配制

1.2.1 PBS液的配制（pH:7.2）

1.2.2 1%红细胞悬液的配置

（1）采新鲜的鸡血，其中加抗凝剂1/5～1/10左右；

（2）分装入10mL的离心管中（未满则用PBS液补足量），配平后用离心机离心10 min，14000rpm/min；

（3）离心结束后，弃去上清液，加PBS吹打，配平后再次离心；

（4）反复离心3次，吹打3次即可；

（5）根据红细胞体积，用PBS配成溶液浓度为1%的红细胞悬液。

1.3 仪器

恒温金属水浴锅CHB-100型（杭州大和热磁电子有限公司）、各种量程微量移液器、微量振荡器、96孔V型微量反应板。

2 实验步骤

2.1 HA试验

具体步骤：按照表2，向1～12孔加25μL PBS；吸取25μL病毒，并从第1孔开始稀释一直稀释到第11孔，11孔稀释完后弃去25μL，第12孔不加病毒；12孔全部再加一遍PBS，剂量为25μL，注意悬空滴加；12孔全部再加一遍1%红细胞悬液，剂量为25μL，注意滴加时要悬空滴加；轻微震荡混匀；放37℃恒温箱20min，观察结果实验结果。

2.2 HI试验

具体步骤：按照表3，向1～12孔加25μL PBS；吸取25μL阳性血清，并从第1孔开始稀释一直稀释到第10孔，10孔稀释完后弃去25μL，第11、12孔都不加血清；4单位病毒的配制：即将一个血凝单位的病毒增加至4倍浓度，例如一个血凝单位为1:64，4个血凝单位则为64/4=16倍稀释（1倍的病毒+15倍的PBS）；从第1孔开始，病毒悬空滴加至第11孔，每孔加病毒25μL，第12孔用25μLPBS代替；振荡混匀，室温或37℃温箱15～30min；每孔加25μL1%红细胞悬液，振荡混匀，室温10min后开始观察，直到结果出现。

3 血凝及血凝抑制试验结果

由表4得出病毒尿囊液的HA效价为27，将HA试验中得到效价为27的尿囊液，用PBS按1:4稀释成4U病毒，然后进行HI试验。

由表5可以得出，该病毒样品既不能被H9亚型禽流感抗血清抑制，也不能被NDV阳性血清抑制，只能被H5亚型禽流感抗血清抑制，其HI效价为28。可初步判断为H5亚型禽流感病毒。

4 小结与讨论

病毒样品HA血凝素效价可达27，HI效价达28，且血凝活性不能被抗新城疫病毒血清和AIV～H9标准阳性血清抑制抑制，排除鸡新城疫和H9，初步判断为H5亚型禽流感。HA和HI试验不仅可以用于禽流感、新城疫等具有血凝性病毒的鉴定，更可用于禽群免疫状态评价。该试验是目前世界卫生组织和国际动物健康组织进行全球流感监测所普遍采用的方法，而且因其具有经济、快速、可靠、操作简便、能够处理大量样品，并能在短时间内报告抗体水平等优点，已成为当前基层兽医实验室疫情监测和免疫抗体检测中最常用的方法。因此灵活掌握HA和HI试验，对畜禽疫情监测工作的开展具有重要意义。

表2HA试验

表3 HI试验

表4 血凝试验结果

表5 血凝抑制试验结果