Box-Behnken响应面法优化孔石莼多糖络合锌工艺

汤陈鹏，吕 峰，王蓉琳

(福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002)

锌是人体必需的微量元素之一，其在人体的生理活动中起着重要的作用。缺锌会导致食欲不振、免疫力降低、儿童发育迟缓等症状，还容易诱发冠心病、高血压、高血糖等疾病[1]，同时男性生殖系统疾病与缺锌也有着密切的关系[2]。无机补锌剂，例如硫酸锌、氧化锌等，在使用时人体吸收率较低，且对胃肠道刺激较大[3]。文献资料表明，与无机锌相比，有机锌在人体的利用率和生理活性方面有着显著的优势[4-6]。

孔石莼是我国的一种大型经济绿藻，属于绿藻门石莼科石莼属，多分布于北太平洋的西部、朝鲜、日本以及中国沿海[7]。孔石莼中含有丰富的营养与活性成分，如多糖、氨基酸、蛋白质、维生素等[8]，特别是孔石莼多糖含量丰富。大量研究证明，孔石莼多糖具有诸多的生物活性，如降血糖[9]、降血脂[10]、抗肿瘤[11]、抗氧化、抗辐射[12]等，开发前景广阔。

多糖的络合改性指的是多糖与金属或某些非金属离子发生络合反应，生成络合物的改性方法。许多研究表明，多糖的络合改性不仅能显著提高其本身的生物活性，甚至还可赋予新的功能；此外，经过络合的金属更容易被生物体所吸收。络合改性已然成为多糖改性领域中颇受重视的一类改性方法。通过络合改性将孔石莼多糖与锌结合，可以获得一种兼具多糖生理活性的有机补锌剂，具有广阔的研究和应用前景，可为孔石莼资源的高值化利用和新型生物补锌剂的开发提供理论依据，而目前尚未有研究对此进行探索。

本研究以孔石莼脱蛋白多糖为原料，采用硫酸锌与其进行络合反应，制备了孔石莼多糖锌络合物，并采用3因素3水平的Box-Behnken响应面法对其络合锌工艺进行了优化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

孔石莼粉末：80目，购于福建海兴保健食品有限公司。

硫酸锌、95%乙醇、柠檬酸、盐酸、碳酸钠，均为分析纯；盐酸，食品级；硝酸、高氯酸，均为优级纯；1 000 mg/L锌标准溶液：国家有色金属及电子材料分析测试中心；纤维素酶(200 000 U/g)：宁夏和氏璧生物技术有限公司；碱性蛋白酶(200 000 U/g)：江苏锐阳生物科技有限公司。

1.2 主要仪器与设备

BSA223S分析天平：北京赛多利斯科学仪器有限公司；HWS24型恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；SK8210LHC型超声清洗器：上海科导超声仪器有限公司；RE52-99型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；DL-5-B离心机：上海安亭科学仪器厂；PHB-3 pH计：上海三信仪表厂；FreeZone 6L落地式冻干机：美国LABCONCO公司；AA-6300C原子吸收分光光度计：日本岛津仪器设备公司。

1.3 试验内容与方法

1.3.1 孔石莼脱蛋白多糖的制备

孔石莼粉末→以料液比1∶30(g/mL)加蒸馏水→使用柠檬酸调节pH=4.8→按每g孔石莼粉末加入400 U已活化的纤维素酶→ 45℃超声提取90 min→煮沸灭酶10 min→200目绢布过滤→ 4 000 rpm离心10 min→收集上清液→真空浓缩→冷藏醇沉过夜→离心、收集固体→加水溶解→真空浓缩→冷冻干燥→孔石莼多糖粗品。

孔石莼多糖粗品→料液比1∶100(g/mL)加蒸馏水→使用碳酸钠调节pH=10.5→按每g孔石莼多糖粗品加入1 400 U已活化的碱性蛋白酶→55℃酶解2.0 h→煮沸灭酶10 min→4 000 rpm离心10 min→收集上清液→调pH至中性→ 7 000 Da透析袋透析36～48 h→真空浓缩→冷冻干燥→孔石莼脱蛋白多糖(多糖含量53%)。

1.3.2 孔石莼多糖络合锌工艺流程

孔石莼脱蛋白多糖→配制成一定浓度的溶液→按既定质量比加入硫酸锌溶液→调节pH→恒温水浴反应90 min→反应液透析除去未发生络合反应的Zn2+→真空浓缩→冷冻干燥→孔石莼多糖锌络合物。

1.3.3 Box-Behnken响应面法优化孔石莼多糖络合锌工艺

基于前期探索性试验，设反应体系的Zn2+浓度3.00 mg/mL、反应时间90 min，以反应温度(X1)、反应体系pH(X2)、孔石莼多糖与Zn2+质量比(X3)为自变量，孔石莼多糖锌络合物锌含量(Y)为响应值，采用3因素3水平的Box-Behnken响应面法优化孔石莼多糖络合锌工艺。3因素3水平的Box-Behnken响应面试验设计的因素水平编码表见表1。

表1 Box-Behnken响应面因素水平编码表

1.4 指标检测与方法

1.4.1 Zn2+标准曲线制作

依照国标GB 5009.14—2017 《食品安全国家标准 食品中锌的测定》[13]的方法，准确吸取锌标准储备液(1000 mg/L)1.00 mL于100 mL容量瓶中，加入3.3%硝酸溶液定容，混匀，配成10 mg/L的锌标准中间液。分别准确吸取锌标准中间液 0.00、1.00、2.00、4.00、 8.00和10.00于100 mL容量瓶中，加入3.3%硝酸溶液定容，混匀，制备成质量浓度分别为 0.000、0.100、0.200、0.400、0.800和1.000 mg/L的系列锌标准溶液，在火焰原子吸收分光光度计中测定其吸光度，得到Zn2+标准曲线。

1.4.2 孔石莼多糖锌络合物锌含量的测定

参照国标GB 5009.14—2017《食品安全国家标准 食品中锌的测定》[13]，称取孔石莼多糖锌络合物0.1 g放入消解罐中，加入浓硝酸、高氯酸进行消解，消解产物稀释定容，测定吸光度，带入回归方程(1)计算Zn2+浓度，锌含量Q计算公式如下：

Q=cVD/1 000m

(1)

式中：Q为锌含量(mg/g)；c为待测液Zn2+浓度(μg/mL)；V为消解产物定容体积(mL)；D为稀释倍数；m为孔石莼多糖锌络合物质量(g)。

2 结果与分析

2.1 Zn2+标准曲线的建立

Zn2+的回归方程为：

y=0.470 02x+0.028 690，R2=0.999 6

(2)

式中：x为待测液Zn2+浓度(μg/mL)；y为吸光度。

2.2 回归方程的建立与方差分析

采用 Design Expert 8.0.5统计分析软件对表2数据进行处理，建立反应温度(X1)、反应体系pH(X2)、孔石莼多糖与Zn2+质量比(X3)3个因素与响应值孔石莼多糖锌络合物锌含量(Y)的回归方程为：

Y=101.72+0.76X1-0.83X2-1.72X3-1.32X1X2-0.43X1X3+1.18X2X3-3.28X12-3.49X22-6.33X32

(3)

为验证回归方程(3)的有效性，对其进行方差分析，结果见表3。

表2 Box-Behnken试验设计与结果(n=3)

表3 孔石莼多糖锌络合物的锌含量方差分析表

注：*表示显著(P<0.05)，**表示极显著(P<0.01)。

Notes：*indicated significant difference(P<0.05)；**indicated extremely significant difference(P<0.01).

2.3 单因素对孔石莼多糖锌络合物的锌含量影响效应分析

对回归方程(3)进行降维分析，将反应温度(X1)、反应体系pH(X2)、孔石莼多糖与Zn2+质量比(X3)三因素的其中两个因素固定为零水平，考察各单因素在不同水平上对孔石莼多糖锌络合物的锌含量(Y)的影响，并得到以其中一个因素为决策变量的偏子回归模型，使用Excel软件绘图得到各因素对孔石莼多糖锌络合物的锌含量(Y)影响的曲线，结果见图1。

结合图1与表3可知，三因素对孔石莼多糖锌络合物的锌含量Y影响的显著性大小依次为孔石莼多糖与Zn2+质量比(X3)>反应体系pH值(X2)>反应温度(X1)。固定其他两个因素为零水平时，锌含量(Y)均随各因素水平的提高先增加后减少。当反应温度X1水平为0.12(即50.60℃)，反应体系pH值X2水平为-0.12(即4.94)，而孔石莼多糖与Zn2+质量比X3水平为-0.14(即2.86∶1)时，孔石莼多糖锌络合物的锌含量均可分别达到最大值，依次分别为101.76 mg/g、101.77 mg/g、101.84 mg/g。

2.4 试验因素间交互作用对孔石莼多糖锌络合物的锌含量影响效应分析

根据表3的方差分析结果可知，试验因素间交互项对孔石莼多糖锌络合物锌含量Y有显著影响(P<0.05)的是X2X3(即反应体系pH值和孔石莼多糖与Zn2+质量比)，有极显著(P<0.01)影响的是X1X2(即反应温度与反应体系pH值)，本研究即对此二项进行分析，结果见图2、图3、表3。

2.4.1 反应温度与反应体系pH的交互作用对孔石莼多糖锌络合物的锌含量的影响

图2中(a)等高线呈椭圆形，说明反应温度X1与反应体系pHX2的交互作用对孔石莼多糖锌络合物的锌含量有极显著影响(P<0.01)；从图2(b)响应面图可以看出，当孔石莼多糖与Zn2+质量比X3固定为零水平(即3∶1)时，反应温度X1在45.0～50.7℃范围内，反应体系pHX2在4.50～4.93范围内，两因素的交互作用对孔石莼多糖锌络合物的锌含量Y的影响呈正相关关系，即锌含量Y随两因素水平上升而增加；而当反应温度X1>50.7℃、反应体系pHX2>4.93的范围内，两因素的交互作用对孔石莼多糖锌络合物的锌含量Y的影响呈负相关关系，即锌含量随两因素水平上升而呈下降趋势。从图2(a)中还可看出，反应体系pHX2轴向等高线分布较密集，说明在本研究的络合反应过程中，反应体系pHX2对孔石莼多糖锌络合物的锌含量的影响较反应温度X1显著。

反应温度的适度上升可以加剧体系中反应分子的运动，促进孔石莼多糖与Zn2+的络合，而反应体系pH的适当提高可以降低体系中H+的浓度，减小其与金属离子竞争络合的程度[14]，从而提高产物的锌含量，因此在一定范围内，当反应温度和反应体系pH同时上升时，两者效应的叠加可以大幅度提高孔石莼多糖锌络合物的锌含量；但是由于络合反应本身是一个放热反应，若温度过高时，Zn2+运动过快，与多糖的络合会变得困难，且已形成的络合物稳定性也会减弱[15]； 而pH过高时，反应体系中游离的Zn2+容易生成Zn(OH)2，导致游离Zn2+浓度明显降低，亦影响络合效果。综上，若当二因素水平均偏低或过高时，两者的交互作用均不利于孔石莼多糖对Zn2+的络合作用。

2.4.2 反应体系pH和孔石莼多糖与Zn2+质量比的交互作用对孔石莼多糖锌络合物的锌含量的影响

结合表3与图3(a)可知，反应体系pHX2和孔石莼多糖与Zn2+质量比X3的交互作用对孔石莼多糖锌络合物的锌含量的影响显著(P<0.05)，且孔石莼多糖与Zn2+质量比X3对锌含量的影响较反应体系pHX2显著。图3(b)显示，当反应温度X1固定为零水平(50℃)时，反应体系pHX2在4.50～4.93范围内，孔石莼多糖与Zn2+质量比X3在2.0∶1～2.8∶1范围内，二者的交互作用对锌含量Y的影响呈正相关关系；而当反应体系pHX2>4.93、孔石莼多糖与Zn2+质量比>2.8∶1的范围内，二者的的交互作用对锌含量Y的影响呈负相关关系。

多糖与金属离子质量比的适当增加，不仅促进二者的络合，提高反应进行程度，还可以提高络合物的稳定性[16]；而反应体系pH的适当提高可以降低体系中H+与金属离子竞争络合多糖，以确保多糖对金属离子的络合，因此在一定范围内，当反应体系pH和孔石莼多糖与Zn2+质量比同时上升时，两者作用的协同效应极大地提高了产物的锌含量。反之，若反应体系pH过高，且孔石莼多糖与Zn2+的质量比过大时，一方面反应体系的Zn2+容易生成Zn(OH)2，使体系中游离Zn2+浓度大幅降低，另一方面孔石莼多糖含量过高，反应体系的粘度变大，阻碍分子运动，两种作用均可明显影响络合效果。综上，当两因素值均过高时，两者的交互作用将显著地降低孔石莼多糖锌络合物的锌含量。

2.5 工艺优化与验证试验

使用Design Expert 8.0.5对回归方程(3)求解，计算得出孔石莼多糖络合Zn2+的最佳工艺条件组合为反应温度50.8℃、pH 4.91、孔石莼多糖与Zn2+质量比2.8∶1，得到孔石莼多糖锌络合物的锌含量的预测值为101.99 mg/g(注：该预测值略低于响应面试验中若干组实际值，其可能是试验误差所致)。为提高实际操作的便利性，将试验条件校正为反应温度50℃、pH 5.0、孔石莼多糖与Zn2+质量比2.8∶1，同时控制反应体系中的Zn2+浓度为3.00 mg/mL、反应时间90 min，进行扩大性验证试验，平行重复3次，所得孔石莼多糖锌络合物中锌含量为(102.41±0.67)mg/g，与理论预测值(101.99 mg/g)相对误差为0.41%，没有显著性差异，说明预测值与实际值拟合性较好，响应面得到的络合工艺参数准确可靠，在实际生产中可行。

3 结论

本研究基于前期探索性试验，在控制反应体系中的Zn2+浓度为3.00 mg/mL、反应时间90 min的前提下，采用Box-Behnken响应面试验设计优化孔石莼多糖络合锌反应的主要工艺参数，建立了反应温度(X1)、反应体系pH(X2)、孔石莼多糖与Zn2+质量比(X3)3个因素与响应值孔石莼多糖锌络合物的锌含量(Y)的回归方程为：

Y=101.72+0.76X1-0.83X2-1.72X3-1.32X1X2-0.43X1X3+1.18X2X3-3.28X12-3.49X22-6.33X32

通过对回归方程的方差分析可知，孔石莼多糖与Zn2+的质量比、反应温度与反应体系pH的交互作用对孔石莼多糖锌络合物的锌含量影响极显著(P<0.01)；反应温度、反应体系pH和孔石莼多糖与Zn2+质量比的交互作用对孔石莼多糖锌络合物的锌含量影响显著(P<0.05)。经过计算和校正，获得孔石莼多糖络合锌的最佳工艺参数组合为孔石莼多糖与Zn2+质量比2.8∶1、反应温度50℃、反应体系pH 5.0，以此条件下进行络合的效果理想，孔石莼多糖锌络合物的锌含量为(102.41±0.67)mg/g，与预测值101.99 mg/g之间的差异不显著(P>0.05)。

综上说明，该响应面模型与实际数据拟合性较好，可以很好地适用于孔石莼多糖络合锌工艺的优化。