溶剂萃取法脱除银杏酸工艺研究

2018-11-01吴元锋徐超奕管成林姚慧敏

浙江科技学院学报 2018年5期

徐京，吴元锋,2，徐超奕，程勇，管成林，姚慧敏

(1.浙江科技学院生物与化学工程学院，杭州 310023;2.浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心，杭州 3100233.浙江天草生物科技股份有限公司，浙江安吉 313300;4.杭州天草科技有限公司，杭州 310013)

银杏叶提取物(ginko biloba extract，GBE)主要含有银杏黄酮(如槲皮素、山奈酚、异鼠李素)、银杏内酯(A、B、C)等活性成分，具有清除自由基、抗氧化、抗炎症、抗细胞凋亡、调节血脂、防治动脉粥样硬化等作用，因此广泛用于防治心脑血管疾病[1-3]。银杏叶提取物中还含有银杏酸，包括C13∶0(R=C13H27)、C15∶0(R=C15H31)、C15∶1(R=C15H29)、C17∶1(R=C17H33)、C17∶2(R=C17H31)等，这类化合物具有致敏性、胚胎毒性、细胞毒性、免疫毒性，因此银杏叶提取物必须脱除银杏酸[4]。德国限定GBE中银杏酸含量应在5 mg/kg以下，中国药典也限定GBE中银杏酸含量应在10 mg/kg以下[5-7]。

目前已有多种银杏酸脱除方法的报道。通过大孔吸附树脂纯化，能使银杏酸的含量控制在5 ppm以下[8-9]。吴向阳[10]等研究了超临界CO2脱除银杏酸工艺，脱除率为79.1%。除此之外，还有发酵法[11-12]、中药配伍减毒法[13]等也可以降低银杏叶产品中的银杏酸含量。为了获得更好的脱除效果，本研究采用有机溶剂萃取法，在保留银杏黄酮和银杏内酯的情况下研究银杏酸脱除工艺。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

1.1.1 主要仪器

Waters e2695高效液相色谱仪，配有2424蒸发光散射检测器和2998紫外检测器，Thermo Biofuge Primo R高速冷冻离心机，RE-52旋转蒸发器，SB-5200DT数控超声波清洗机，XMTD-204数显式电热恒温水锅。

1.1.2 材料与试剂

原料：5种银杏叶样品于2017年3月购自山东、河南、河北、湖北及云南的中药房，分别命名为YP1、YP2、YP3、YP4、YP5，用中草药粉碎机将银杏叶研磨成粉，干燥储存备用。

标准品：银杏酸标准品(C13∶0、C17∶1)、银杏内酯标准品(银杏内酯A、B、C)、银杏黄酮标准品(山奈酚标、槲皮素标、异鼠李素标)，均购自上海长哲生物科技有限公司。

主要试剂：磷酸、乙醇、磷酸氢二钠、三氟乙酸等为分析纯，甲醇和乙腈为色谱纯，均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 银杏叶提取物制备

银杏叶提取物按照文献[14]方法制备：银杏叶用中草药粉碎机粉碎，称取70 g粉末于圆底烧瓶中，加入500 mL体积分数为70%的乙醇溶液，回流提取2 h，抽滤，残渣再用500 mL体积分数为70%的乙醇溶液回流提取2 h。合并提取液，静置24 h，上清液旋转蒸发浓缩，浓缩液在-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2 最适pH条件

配制5份体积分数为60%的乙醇溶液，分别用盐酸溶液调节pH值至2、3、4、5和6。分别量取20 mL正己烷、20 mL不同pH值的乙醇溶液、2 mL银杏提取浓缩液加入分液漏斗，振荡萃取，待静置分层后，将上下相分别蒸干，体积分数为50%的甲醇溶液定容至10 mL，分别用高效液相色谱测定上下相中的银杏酸、银杏内酯和银杏黄酮含量。

1.2.3 最适乙醇体积分数

在最适pH条件下配制体积分数为0%、20%、40%、60%、80%的乙醇溶液，取20 mL正己烷、20 mL不同体积分数的乙醇溶液、2 mL银杏提取浓缩液加入分液漏斗，萃取、浓缩后定容，分别用高效液相色谱测定上下相中的银杏酸、银杏内酯和银杏黄酮含量。

1.2.4 最适有机相

在最适pH条件和乙醇体积分数下，以正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯分别作为有机相。取20 mL不同有机相，20 mL最适pH和体积分数的乙醇溶液、2 mL银杏提取浓缩液加入分液漏斗，萃取、浓缩后定容，分别用高效液相色谱测定上下相中的银杏酸、银杏内酯和银杏黄酮含量。

1.2.5 分析方法

本研究所用银杏酸、银杏内酯和银杏黄酮的分析均采用欧洲药典方法[5]进行。

1.2.5.1 银杏酸分析方法色谱柱：WelchromC8(4.6 mm×250 mm，5 μm)反向色谱柱色谱柱，检测器为2998紫外光检测器。流速为1 mL/min，流动相A为体积分数0.01%三氟乙酸水溶液，流动相B为体积分数0.01%三氟乙酸乙腈溶液。梯度条件：0～30 min，25% A变化到10% A，维持5 min，1 min内变化到25% A，维持9 min。柱温25 ℃，上样量50 μL，波长210 nm。

1.2.5.2 银杏黄酮分析方法色谱柱：WondaCract ODS-2(4.6 mm×250 mm，5 μm)反向色谱柱检测器，2998紫外光检测器。流速1 mL/min，流动相A为0.3 g/L磷酸水溶液，流动相B为甲醇。梯度条件：0～1 min，60%A；1～20 min，A从60%变化到45%；20～21 min，A从45%变化到0%，维持4 min。

表1 银杏内酯液相分析洗脱梯度Table 1 Elution gradient ofginkgolidesanalyzed by HPLC

柱温25 ℃，上样量10 μL，波长370 nm。

1.2.5.3 银杏内酯分析方法色谱柱：WondaCract ODS-2(4.6 mm×250 mm，5 μm)反向色谱柱，2424蒸发光散射检测器，流速1 mL/min，流动相A为甲醇，流动相B为水，柱温25 ℃，上样量10 μL，增益500，气体压力40 psi(2.76×105Pa)，动力级别10，漂移管温度70 ℃。梯度条件见表1。

1.2.5.4 分配比计算上相和下相分别定容到10 mL后，用液相法测定上相和下相中银杏内脂、银杏黄酮和银杏酸的质量浓度(mg/mL)。银杏内酯为银杏内酯A、B和C含量的总和；银杏黄酮为槲皮素、山奈酚和异鼠李素含量的总和；银杏酸为银杏酸A和银杏酸B含量的总和。两相的分配比按照下列公式计算：

分配比=水相中各活性成分质量浓度(mg/mL)/有机相中各活性成分质量浓度(mg/mL)。

2 结果与讨论

2.1 银杏内酯、银杏黄酮和银杏酸标准曲线

根据1.2.5分析方法，配制系列浓度的银杏内酯、银杏黄酮和银杏酸标准液，HPLC测定标准曲线，结果见表2。

表2 银杏内酯、银杏黄酮和银杏酸标准曲线Table 2 Standard curves of ginkgolides, ginkgo flavones and ginkgolic acids

图1 5种银杏叶样品银杏酸含量Fig.1 Ginkgolic acid contents in 5species of ginkgo sample leaves

2.2 不同产地银杏叶中活性物含量对比

通过HPLC法测定了不同产地银杏酸含量，结果如图1所示，表明银杏叶中总银杏酸含量具有一定的区域性，该结果与文献[15]报道一致。为了研究脱酸效果，本研究采用银杏酸含量最高的产自云南的银杏叶YP5为原料开展研究。经过溶剂萃取、干燥后得到银杏叶提取物，银杏酸含量为1.78 mg/g，其含量远超中国药典要求。

2.3 水相pH值对分配比的影响

正己烷为有机相，60%乙醇为水相，水相pH值分别为2、3、4、5和6时，银杏叶提取物中各物质的上下相分配比如图2所示。

从图2中可知，水相pH值对银杏叶提取物中各成分的分配比有较大的影响。银杏黄酮几乎不溶于正己烷，全部分配于下相。银杏内酯也主要分配于下相，pH值越低，在下相分配越多。而银杏酸却刚好相反。当pH值为6时，大部分银杏酸也分配在下相，当pH值为2时，分配比最少，表明在此pH值下，银杏酸更多地分配在上相。由此可知，pH值为2时，银杏酸的脱除效果最好。

图2 水相pH值对银杏内酯和银杏酸分配比的影响Fig.2 Effects of pH value of aqueous phase on partition ratios of ginkgolide and ginkgolic acid

2.4 水相乙醇体积分数对分配比的影响

正己烷为有机相，水相pH值为2，乙醇体积分数为0%、20%、40%、60%和80%时，银杏叶提取物中各物质的上下相分配比如图3所示。

图3 水相乙醇体积分数对银杏内酯和银杏酸分配比的影响Fig.3 Effects of ethanol volume fraction of aqueous phase on partition ratios of ginkgolide and ginkgolic acid

在不同乙醇体积分数下，银杏黄酮全部分配在下相。由图3可知，乙醇体积分数对银杏内酯的分配也有一定的影响，乙醇体积分数越高，分配比越低，表明在乙醇含量较低时银杏内酯在下相的分配比越高。乙醇体积分数对银杏酸的影响较为复杂，在纯水、乙醇体积分数为60%和80%时，分配比较高，而在乙醇体积分数为40%时，分配比最低，表明在该乙醇浓度下最适合脱除银杏酸。

2.5 有机相对分配比的影响

水相pH值为2，乙醇体积分数为40%时，分别以正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷和乙酸乙酯为有机相，银杏叶提取物中各物质的上下相分配比如图4所示。

从图4可知，以正己烷为有机相时，银杏黄酮、银杏内酯都集中在水相，银杏酸则分配在有机相，表明正己烷为有机相时，脱除效果更好。然而用其他有机溶剂为有机相时，银杏黄酮在两相均有分布。二氯甲烷或三氯甲烷为有机相时，银杏内酯分配比较高，表明银杏内酯也基本分配在水相。从脱酸效果来看，正己烷和二氯甲烷的脱酸效果较好，但是二氯甲烷脱酸时银杏黄酮也有损耗，综上所述，正己烷为最适脱酸溶剂。