脑黑质单侧注射鱼藤酮制备帕金森小鼠模型方法的建立和行为分析

王普

【摘 要】目的：帕金森是目前医学难题，尚缺乏有效的治愈措施，针对其相关研究成为医学重点方向。目的：注射鱼藤酮制备帕金森小鼠模型方法探讨，并从行为学神经元形态学角度分析模型。本文实验方法和数据参考新乡医学院谷争、候田田、周度爽、赵二奇、赵营在脑黑质单侧注射鱼藤酮制备帕金森小鼠模型方法的建立和行为分析一文。方法：为了使得实验能够清楚的展现效果，采取实验组、溶媒组和正常组来进行。每组各10只清洁级NIH小鼠。实验组采用立体定向微量注射法将溶解于二甲基亚砜（DMSO）的鱼藤酮注射入小鼠脑右侧黑质致密区，溶媒组以同样的方法仅注射相同体积的DMSO，正常组不做任何处理。结果：建模后，正常组、溶媒组和实验组小鼠死亡率比较无统计学意义（P>0.05）。实验组小鼠体重、爬杆实验评分评分均较对照组和溶媒组建模后明显下降（P<0.05）。建模后，实验组小鼠脑黑质TH水平注射侧脑黑质区多巴胺能神经元较对侧明显减少（P<0.05）。结论：鱼藤酮能选择性损毁黑质多巴胺能神经元，可较快建立稳定的成功率较高的帕金森模型。

【关键词】鱼藤酮；脑黑质；多巴胺神经元；帕金森病

【中图分类号】R742.5 【文献标识码】A 【文章编号】1005-0019（2018）15-0-01

1 材料与方法

1.1 材料 本实验采用的小鼠达到无特定病原（SPE）级且美国国立卫生研究院（NIH）要求的，由河南省华兰生物小动物饲养中心提供的体重在22～25g之间。武汉三洹医药化工有限公司生产的鱼藤酮，武汉博士德生物工程有限公司生产的阿扑吗啡、兔抗酪氨酸羟化酶、免疫亲和素-生物素复合物（strept avidin-biotin complex，SABC）试剂盒，北京中彬金桥生物技术有限公司生产的二氨基联苯胺（Diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒，成都仪器厂生产的ST-5ND-B型小鼠脑立体定向仪，安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司生产的ZH-GSZ型高级颅骨钻，还有日本尼康生产的免疫组织化学成像系统。

1.2 模型建立及分组

实验组、溶媒组和正常组随机分得10只小鼠，均同等正常饲养，反复对其进行旋转行为检测，当确定没有旋转行为后进行实验。（1）实验组：腹腔注射水合氯醛350 mg·kg-1，将小鼠麻醉后，严格颅平位（使用耳栏在立体框架中稳定小鼠头部，前囟与后囟水平高度相差0.1 mm以下）固定于小鼠脑立体定向仪，注射靶点坐标为：前囟门后3.0 mm；外侧向中线1.3 mm；头骨表面腹侧4.7 mm，微量注射器抽取溶于二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide， DMSO）的鱼藤酮1 μL，0.5 g/L，速度为0.2 μL·min-1，缓慢进针至靶点，注射完毕留针5 min待药物充分弥散，缓慢匀速拔针。给与碘伏涂抹消毒，撒少量青霉素粉末，缝合伤口。术后碘伏连续涂抹3 d/每日二次。（2）溶媒组：小鼠固定方法及注射靶点同实验组，给予DMSO注射，每只1 μL。（3）正常组：不做任何处理，与实验组和溶媒组给予相同的饲养方式饲养。

1.3 行为检测及评分 对三组小鼠进行处理四周后，将阿卟吗啡注射到三组小鼠的颈后皮下，这可以诱导小鼠进行旋转。注射后5分钟左右，小鼠适应环境了开始进行计时，记录10分钟内各个小鼠旋转的圈数。当恒定自发性左侧旋转且比较稳定，每小时旋转的圈数超过210，除此之外，还会出现震颤、竖尾、活动迟缓等异常表现，可以判定模型建立成功。

1.4 爬杆实验 选取一根直徑为1.5厘米长为50厘米的木杆，在木杆顶端固定一个直径为25厘米的软木小球，同时为了防止木杆打滑，在木杆上缠绕纱布。木杆竖直放置，让小鼠置于小球上面，做如下记录：（1）小鼠从小球爬下来的时间；（2）完成上半段木杆爬行的时间；（3）完成下半段的爬行时间。根据时间的长短进行评分，如果3秒内完成某一个过程记3分，如果3到6秒内完成记2分，超过6秒的记1分。然后统计各组小鼠的得分情况。

2 结果

2.1 3组小鼠生存情况比较

溶媒组和正常组小鼠在6周观察期间均未见死亡，实验组小鼠在建模2周和3周后死亡。三组建模建模后小鼠的死亡率比较无统计学意义（P<0.05）。

2.2 3组小鼠体质量变化比较 结果如表1显示，与建模前比较，对照组、溶媒组和实验组建模后4周小鼠体质量均显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。建模后对照组、溶媒组小鼠体质量明显高于实验组，差异有统计学意义（P<0.05）。对照组和溶媒组比较无统计学意义（P>0.05）。

2.3 爬杆实验 结果如表2所示，建模前，由于P>0.05，这样针对三组小鼠爬杆实验的得分就失去了统计学意义，没有研究价值。建模后，只有实验组的P>0.05，其他两组P均大于0.05，因此建模后的实验组小鼠的爬杆实验得分统计与建模前有明显下降，具有统计学意义。

3 讨论

帕金森已经成为影响老年人中发病率逐步升高的一种疾病，严重影响着患者的生活，对患者家庭也是很大的负担。但是目前为止，对于帕金森综合征的发病机制还不是十分清楚，因此影响着对其治疗。目前普遍认为是选择性黑质多巴胺神经元缺失和泛素染色阳性的胞质中包涵体形成是导致PD的主要原因之一。目前的药物对PD还无法从根本上进行治疗。因此针对PD的有效药物的要发和筛选成为该领域急需解决的问题。目前关于PD临床前药物疗效的筛选主要在大鼠上进行，在小鼠进行实验的报道还比较少，但是由于小鼠与人有比较高的基因同源性，因此在小鼠进行建模研究，对PD药物的研发具有重要的作用。本研究发现，鱼藤酮定位给药，会降低小鼠的死亡率，同时小鼠的病理学和行为学变化与人类帕金森患者比较类似，具有研究的价值。

参考文献

谷争，候田田，周度爽，赵二奇，赵 营.脑黑质单侧注射鱼藤酮制备帕金森小鼠模型方法的建立和行为分析[J].新乡医学院学报.2016（02）.

何莉.老年帕金森病患者血浆同型半胱氨酸水平与认知障碍相关性分析[J].新乡医学院学报.2014（06）