镁对两年生艾纳香生物量、抗氧化酶活性及有效成分积累的影响

王丹 蓝惠萍 张影波 于福来 陈晓鹭 黄梅 王凯 庞玉新

摘 要 以两年生艾纳香苗为实验材料，用七水合硫酸镁提供镁素，研究镁对艾纳香药材生物量、3种抗氧化酶活性、总黄酮和l-龙脑百分含量和单株产量。结果表明，镁显著增加了艾纳香生物量。与其他处理组相比，5、10和80 mg/mL镁处理的SOD和CAT活性较高，而POD活性较低。不同浓度的镁处理显著提高了艾纳香中总黄酮百分含量、总黄酮单株产量以及l-龙脑单株产量，其中5、10和80 mg/mL镁处理组最显著。而10 mg/mL镁处理下的l-龙脑百分含量最高。因此，综合以上结果，10 mg/mL镁处理为两年生艾纳香施用的最佳浓度，能显著提高药材生物量和药材质量。

关键词 镁 ；艾纳香 ；生物量 ；总黄酮 ；l-龙脑 ；抗氧化酶

中图分类号 S567，71 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.07.011

Abstract The seedlings of Blumea balsamifera （L.） DC at the age of 2 years old were treated with different concentrations of magnesium （Mg） to determine their biomass， 3 antioxidant enzyme activities and the percentage composition and yield per plant of total flavonoids and l-borneol. The results showed that the different concentrations of Mg significantly increased the biomass. The activities of SOD and CAT in the treatments with Mg at 5， 10 and 80 mg/ml were higher， while the activity of POD was lower. The different concentrations of Mg significantly increased the percentage composition and yield per plant of total flavonoids， and the 80 mg/mL Mg treatment had the highest percentage composition and yield per plant of total flavonoids. The percentage composition and yield per plant of l-borneol were the highest in the 10 mg/ml Mg treatment. Therefore， the best concentration of Mg was 10 mg/ml for dressing the 2 years old seedlings of B. balsamifera （L.） DC， which increased significantly the biomass and the quality of B. balsamifera （L.） DC.

Keywords magnesium （Mg） ； Blumea balsamifera ； biomass； total flavonoids ； L-bornoel ； antioxidant enzyme

艾納香[Blumea balsamifera （L.） DC.]是中国药典（2015版一部）规定的天然艾片（l-龙脑）的唯一来源。艾片是艾纳香的新鲜叶经提取加工制成的结晶，龙脑计算，不得少于85.0%，具有开窍醒神，清热止痛功效，常用于热病神昏、痉厥，中风痰厥，气郁暴厥，中恶昏迷，目赤，口疮，咽喉肿痛，耳道流脓等[1]。近年来，由于人们对艾片需求的不断增加，导致野生艾纳香资源已不能满足生产的需要。因此，人工栽培艾纳香成为解决这一问题的必然途径[2]。何元农等[3-4]研究发现，3种农家肥（圈肥、油枯和柴灰）、3种一元化肥（尿素、过磷酸钙和氯化钾）以及复合肥可以显著提高艾纳香经济产量和生物产量，氮肥可以提高艾纳香的产量和有效成分含量，但是要控制用量。王丹等[5-10]研究发现，在冬季艾纳香生长的迟缓期，施用钙、镁、锰元素以及萘乙酸、赤霉素和DA-6等可以显著促进艾纳香生长，提高叶、茎和根的生物量，显著提高有效成分总黄酮和l-龙脑的单株产量，但是对总黄酮和l-龙脑质量分数的提高作用不显著。蓝惠萍等[11]发现，氮、磷、钾元素配施可以显著提高艾纳香产量和l-龙脑相对含量的积累，对产量影响作用依次为氮>钾>磷。

镁作为继氮、磷、钾之后植物第四大必需营养元素，是植物生长发育的重要营养元素，其供给水平直接影响着植物的生长发育和生物量积累[7]。镁是植物细胞中重要的二价阳离子，是叶绿素的中心离子，还是很多酶的活化剂，参与植物能量代谢，对促进植物生物量积累等具有重要作用[12]。通过前期研究发现，1.5、15和150 mg/mL 镁对一年生长期的艾纳香株高、地径、叶长、叶宽等生长指标以及药材产量有显著的促进作用，对l-龙脑百分含量和单株产量的增加有促进作用。在此基础，通过细化镁素浓度和增大样本量，进一步研究镁对两年生艾纳香生长期产量、抗氧化酶以及有效成分l-龙脑和总黄酮百分含量和单株产量的影响。以期更加了解镁对不同生长年限艾纳香产量和质量的影响，确定最适宜的施肥时期、施肥量，为后期指导艾纳香施肥提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选择长势基本一致的两年生艾纳香苗为实验材料，该材料经中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所研究员庞玉新鉴定为Blumea balsamifera （L.） DC.，以MgSO4·7H2O提供镁元素，共设置5个镁处理浓度：5、10、20、40、80 mg/mL，另设不施肥和水，不进行任何处理的空白对照组CK。分别于6月5日和7月5日进行2次施肥，于12月15日进行取样，重复4次。

1.2 方法

1.2.1 生物量的测定

使用电子秤测定艾纳香药材叶片生物量。

1.2.2 3种抗氧化酶活性测定

选取每个处理组下的每棵艾纳香植株的成熟叶片，去除叶脉，在固定的区域剪成长1.0 cm，宽0.2 cm左右的细丝，混和均匀，精密称定0.5 g，加入4.5 mL的PBS溶液（0.1 mol/L，pH=7.4），按质量（g）体积（mL）比1∶9进行匀浆，6 000 r/min离心10 min，得到10%的组织匀浆，置于-20℃下，备用。分别按照超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性测定试剂盒说明书的操作步骤进行测定。

1.2.3 总黄酮百分含量和单株产量测定

精密称取样品粉末（过20目筛）适量，置具塞锥形瓶中，加75%乙醇溶液25 mL，称重。在40 kHz、功率为400 W的超声条件下提取40 min，静置冷却，称重，用75%乙醇补足减少的质量，摇匀，过滤，取1 mL续滤液置于25 mL容量瓶中，加75%乙醇约至10 mL，加5% NaNO2溶液1 mL，摇匀，放置5 min，再加10% Al（NO3）3 溶液1 mL，摇匀，放置5 min后，加4% NaOH 溶液10 mL，最后以75%乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min。以相应的试剂溶液为空白对照，使用紫外分光光度仪在509 nm处测定吸光度A，计算其百分含量。再将总黄酮百分含量与艾纳香单株生物量相乘，获得总黄酮单株产量[7]。

1.2.4 l-龙脑含量测定

依据《中国药典》（2015版）的气相色谱法（GC）测定艾纳香中l-龙脑百分含量[1]。精密称取艾纳香新鲜叶3.000 g置于50 mL具塞试管中，加入乙酸乙酯溶液24 mL，封口，超声处理40 min，静置并抽滤，滤液转移至25 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至25 mL，摇匀，移取2.0 mL于10 mL容量瓶中，加入内标液水杨酸甲酯1.0 mL，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀。采用HP-5石英毛细管色谱柱（0.32 mm×30 m，0.25 μm），以50℃为起始温度，保持2 min，先以5℃/min升温至100℃，然后以20℃/min升温至200℃，保持3 min；进样口温度220℃；检测器温度240℃；进样量为0.6 μL，不分流。再将l-龙脑百分含量与艾纳香单株生物量相乘，获得l-龙脑单株产量。

2 结果与分析

2.1 镁对两年生艾纳香叶片生物量的影响

由图1可知，不同浓度的镁处理对艾纳香叶片生物量影响结果不同。与CK组相比，5个浓度镁处理组艾纳香叶片生物量均显著增加，分别增加了35.29%，46.28%，26.67%，33.33%和38.04%。5个镁处理组间叶片生物量差异不显著。

2.2 镁对两年生艾纳香SOD活性的影响

由图2可知，不同浓度的镁处理对艾纳香SOD活性影响结果不同。随着镁浓度浓度的增加，SOD活性呈现出先下降再上升的趋势。CK组和40 mg/mL 镁处理组的SOD活性最低，分别为34.09和33.30 U/g FW/min，显著低于5、10和80 mg/mL 镁处理组，分别降低32.28%、28.58%、26.66%和33.85%、30.23%、28.36%。

2.3 镁对两年生艾纳香POD活性的影响

由图3可知，不同浓度的镁处理对艾纳香POD活性影响结果不同。5、10和80 mg/mL 镁处理组POD活性最低，明显低于40 mg/mL 镁处理组，分别降低了18.67%、17.27%和16.18%。

2.4 镁对两年生艾纳香CAT活性的影响

由图4可知，不同浓度的镁处理对艾纳香CAT活性影响结果不同。5和80 mg/mL镁处理组CAT活性最高，分别为16.57和15.32 U/gFW/min，显著高于CK组45.35%和34.39%，与其他处理间差异不显著。

2.5 鎂对两年生艾纳香总黄酮百分含量的影响

由图5可知，不同浓度的镁处理对艾纳香中总黄酮百分含量增加均有不同程度促进作用，显著高于对照处理组。其中，80 mg/mL镁处理组的总黄酮百分含量最高，为1.62%，分别是CK组以及5～40 mg/mL 镁处理组的7.36、2.22、2.10、3.45和2.61倍。其次是5和10 mg/mL 镁处理组，总黄酮百分含量分别为0.73%和0.77%，显著高于CK组和20 mg/mL 镁处理组。

2.6 镁对两年生艾纳香总黄酮单株产量的影响

由图6可知，不同浓度的镁处理对艾纳香中总黄酮单株产量增加均有不同程度促进作用，显著高于CK组。80 mg/mL 镁处理组最高为5.62 kg，显著高于CK和其他处理组，分别是CK组以及5～40 mg/mL 镁处理组的10.37、2.26、1.97、3.75和2.69倍。其次，是10 mg/mL 镁处理组，为2.86 kg，显著高于其他处理组。CK组总黄酮单株产量最低，仅为0.54 kg。

2.7 镁对两年生艾纳香l-龙脑百分含量的影响

由图7可知，不同浓度的镁处理对艾纳香中l-龙脑百分含量影响不同。10 mg/mL 镁处理组的l-龙脑百分含量最高，显著高于CK、5和40 mg/mL 镁处理组，分别增加了34.09%、28.26%和43.90%，与20和80 mg/mL 镁处理组差异不显著。

2.8 镁对两年生艾纳香l-龙脑单株产量的影响

由图8可知，不同浓度的镁处理对艾纳香中l-龙脑单株产量增加均有不同程度促进作用。其中，10 mg/mL 镁处理组的l-龙脑单株产量最高，为2.21 kg，显著高于CK和其他处理组，分别是CK组以及5～80 mg/mL 镁处理组的1.99、1.40、1.29、1.60和1.26倍。其次为80 mg/mL 镁处理组，显著高于CK组和40 mg/mL 镁处理组，与5和20 mg/mL 镁处理组间差异不显著。

3 讨论与结论

镁是植物生长和发育所必需的中量营养元素，对植物生长发育起至关重要的作用[13]。镁是合成植物叶绿素的必需元素，有利于植物光合作用，进而促进植物的生长和生物量积累[14]。这与本研究的结果一致，不同浓度的镁显著促进艾纳香生物量的积累，提高药材产量。

植物体自身的抗氧化系统可抵御外界不良环境的影响，当植物受到营养元素缺乏、重金属毒害等逆境胁迫时，活性氧产生加快，保护酶防御系统遭到破坏，活性氧清除能力下降[15]。SOD、POD和CAT是植物体内活性氧清除系统的3种关键酶，是植物体内活性氧酶促清除系统中的一种重要的防御酶，可催化超氧阴离子快速歧化成H2O2和O2-，在减轻脂质过氧化作用和膜伤害方面起重要作用，在维持活性氧产生与清除过程中起到重要作用[16-17]。而Mg+具有膜稳定性，参与离子运输调控，调节抗氧化酶活性等多种生理功能[14]。本研究发现，施加不同浓度的镁可以提高艾纳香的SOD和CAT活性，其中5、10和80 mg/mL 镁处理组SOD活性最高，5和80 mg/mL 镁处理组CAT活性最高。这与镁在花生[16]、大豆[17]、厚皮西瓜[18]上的研究结果基本一致。POD活性与二者结果相反，5、10和80 mg/mL 镁处理组POD活性最低，显著低于CK组和40 mg/mL 镁处理组。这说明适当浓度的镁可以提高艾纳香SOD和CAT活性，降低POD活性，维持植物正常生理。本试验结果和前人的研究结果表明，适当浓度的镁可以调节植物抗氧化酶系统，但是参与作用的抗氧化酶种类和活性则因物种不同而有所差异[19]。

镁不仅对植物生长、生理等初生代谢有影响，对植物次生代谢也有影响。本研究发现，不同浓度的镁均可以提高艾纳香总黄酮百分含量和单株产量。这可能由于镁是植物体内多种酶的活化剂，几乎所有的磷酸化酶、磷酸激酶、二磷酸核酮糖羧化酶都需要镁的激活或者活化，并且镁还是一些植物酶的重要组成部分，影响植物初生和次生代谢过程[12]。与总黄酮影响结果不同，只有10 mg/mL 镁处理对l-龙脑百分含量和单株产量积累的促进作用最显著，其他处理组对l-龙脑百分含量影响不显著，对l-龙脑单株产量的提高有不同程度的促进作用。这可能由于镁是构成l-龙脑生物合成关键酶的必需元素。单萜合酶是催化l-龙脑合成的第一个酶，以单体或同型二聚体的形式催化反应，每个单体的催化都需要结合二价金属离子Mg2+，并通过氢键络合H2O-Mg2+复合物和自由H2O以形成基本空间结构。后续的催化状态需要继续结合Mg2+，稳定C端空间结构[20-23]。这可能是由于镁通过影响单萜合酶的催化活性，来影响l-龙脑的形成和积累。

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