三种姜属植物花粉活性检测及贮藏条件研究

魏麟懿 林佩兰 王玮 王英强

摘 要 杂交育种过程中的异地授粉和花期不遇问题一直是困扰着科研工作者的难题。因此，亟需探究出一种能长时间保存花粉且能较好地保留花粉活性的方法。以光果姜、珊瑚姜和红球姜3种姜属植物花粉为试验材料，筛选花粉活性最佳检测方法、检测花粉常温下的活性变化并探讨花粉最佳贮藏条件，以解决杂交授粉中异地授粉和花期不遇的问题。结果表明：MTT染色法能快速检测3种姜属植物花粉活性；在自然状态下，3种姜属植物在刚开花时花粉活性较高，花粉活性随放置时间的延长而降低，光果姜花粉常温下的放置时间较其余2种花粉时间长；光果姜花粉和红球姜花粉的最佳贮藏方法为-80℃不干燥，珊瑚姜花粉最佳贮藏方法为-80℃干燥，最佳解冻方法均为直接取出。

关键词 光果姜 ；珊瑚姜 ；红球姜 ；花粉检测 ；花粉贮藏

中图分类号 S573+.9 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.07.010

Abstract The problem of ex situ pollination and different flowering time at cross breeding stage has always been an troublesome issue for the breeders. Therefore， it is very necessary to develop a method to store pollen for a longer time and to retain well the pollen viability. Pollen of Zingiber nudicarpum， Z. corallinum and Z. zerumbet were stored under various conditions to select their optimum storage conditions， and their viability was detected to observe its change at the ambient temperature to select an optimum detection method for pollen. The results showed that the pollen viability of the three species of Zingiber was tested accurately by MTT staining. Under the natural condition， the pollen viability of these three species of Zingiber was high at the initial flowering stage and decreased with time. The pollen of Z. nudicarpum were stored for a longer time than that of the other two Zingiber species under the room temperature. The best storage condition for pollen of Z. nudicarpum and Z. zerumbet was to store at -80℃， while the pollen of Z. corallinum were stored dry at -80℃. The best thawing method is to take the pollen out directly from the storage.

Keywords Zingiber nudicarpum ； Z. corallinum ； Z. zerumbet ； pollen detection ； pollen storage

姜屬（Zingiber）为多年生草本植物，约有80种，分布于亚洲的热带、亚热带地区，我国有14种，产于西南部至东南部[1]，大部分的姜属植物都具有优良的观赏价值[2]。其中，光果姜（Z. nudicarpum）、珊瑚姜（Z. corallinum）和红球姜（Z. zerumbet）是姜属植物中有名的观赏植物[2]，光果姜具有殷红的锥形花序，珊瑚姜具有独特的纺锤形花序[3]，红球姜具有鲜红色球果状的花序[4]。若能将这3种植物成功杂交，有可能培育出具有更高观赏价值的新品种。

这3种植物在杂交过程中存在花期不遇和异地授粉的问题[2-5]，且其花粉活性到目前为止尚未被大众了解。因此，需要对这3种植物花粉活性进行测定并进行花粉贮藏。花粉是种子植物的雄配子体[6]，其活性直接决定植物育种的成败；在生产和杂交育种时，经常会进行远距离或不同开花期的亲本间杂交育种，需要对花粉粒的活性进行保存，而花粉贮藏是花粉活性保存的较好方法[7]。因此，研究花粉粒活性和贮藏条件很有实践意义。

本试验对这3种姜属植物的花粉活性及贮藏条件进行初步探究，旨在为花粉的采集、保存以及杂交育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为光果姜、珊瑚姜和红球姜盛花期的新鲜花粉，其中光果姜和红球姜引种于海南，栽培在华南师范大学生物园，珊瑚姜生长于广东省河源市紫金县的自然种群。每种姜属植物随机采集盛花期刚开放的花10朵（每花序只取1朵），剥取花药，用解剖针将花粉收集并混合均匀，置于干燥清洁的离心管中，备用。

1.2 方法

1.2.1 花粉活性检测方法筛选

由于前人并未对3种姜属植物花粉的活性检测方法进行探讨，所以在测定花粉活性之前，需要进行花粉活性检测方法的筛选。本试验将进行MTT染色法、联苯胺染色法、TTC染色法以及培养基法的筛选，并与柱头涂抹法进行对比，得到最佳花粉活性检测方法。

（1）MTT染色法

参照于安民[8]的方法：用牙签取适量花粉置于载玻片上，滴入适量MTT染液，搅拌均匀后风干，再滴入适量MTT染液，再风干后滴入MTT染液，在显微镜下观察。

（2）联苯胺染色法

参照左丹丹[9]的方法：用牙签取适量花粉置于载玻片上，加入1滴联苯胺-甲萘酚混合液和1滴0.3%过氧化氢溶液，静置3～4 min后，在显微镜下观查。

（3）TTC染色法

参照胡适宜[10]的方法：用牙签取适量花粉置于载玻片上，滴入适量TTC染液，放置15～20 min后，在显微镜下观察。

以上3种染色法在显微镜下观察，每种方法做6个装片的重复，每个装片取3个视野，每个视野不少于200粒花粉，与隔火烤至深黄色的灭活花粉进行染色对照，判断是否成功染色，统计花粉的染色数量，得出花粉平均活性。

花粉活性计算公式为：花粉活性=视野中被染色的花粉数/视野中花粉总数×100%

（4）培养基法

将蔗糖培养液设置0%、3%、5%、8%、10%、12%、15% 7个浓度梯度，选取对这3种花粉萌发影响较大的5个浓度，将H3BO3培养液设置0%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04% 5个浓度梯度，将花粉与含有不同蔗糖和H3BO3的培养液充分混合，培养约2 h后统计花粉萌发率，花粉管长度大于花粉直径视为花粉萌发，每个处理做3个装片的重复，每个装片取3个视野，每个视野不少于100粒花粉。对比不同配方的花粉萌发率，得出测定花粉活性的最佳配方。

以上4种方法得出的花粉活性均要与柱头涂抹法的结果进行对照，得出最佳的花粉活性检测方法。

（5）柱头涂抹法

将即将开放的花蕾套袋，待花开后进行人工异花（异株）授粉处理，授粉2 h后取下花朵（共10朵，每花序只取1朵），将雌蕊置于FAA中固定一段时间后转入70%酒精中保存备用。实验室内处理材料，用不同浓度的乙醇溶液（70%、50%、30%、蒸馏水）梯度复水，NaOH溶液软化透明，苯胺蓝染色[10]，荧光显微镜下观察、拍照，记录花粉的萌发情况，统计柱头上的花粉数量及萌发的花粉数量，计算花粉萌发率。

花粉萌发率计算公式为：花粉萌发率=柱头上萌发的花粉数/柱头上的花粉数×100%

1.2.2 常温下花粉活性变化的检测

为了确保杂交工作的顺利进行，需要对3种姜属植物花粉在常温下的花粉活性变化规律进行了解。在盛花期开花时进行花粉采集并立即进行花粉活性检测，并于每天同一时间点对同一批花粉进行花粉活性检测，直至花粉失去活性为止。花粉活性的检测方法为1.2.1中最佳花粉活性检测方法，统计花粉活性，得出花粉活性變化情况。

1.2.3 花粉贮藏条件的筛选

为了解决不同种之间的花期不遇和异地授粉问题，需要对花粉进行贮藏保存。所以，需要对花粉贮藏条件进行筛选，得出最有利于花粉活性保存的条件。本试验将会对低温和干燥对花粉活性的影响进行探究，具体方法如下：将花粉分装于离心管中，分别进行室温干燥、4℃不干燥、4℃干燥、-20℃不干燥、-20℃干燥、-80℃不干燥、-80℃干燥贮藏。每隔30 d用1.2.1中最佳花粉活性检测方法检测花粉活力，比较各种贮藏方法的花粉活性，筛选出最佳的贮藏条件。

由于花粉在-20℃和-80℃中贮藏取出后，需要进行花粉解冻。所以，需要对花粉解冻条件进行筛选。将花粉分装于离心管中，置于-20℃和-80℃冰箱内30 d后，分别用表1 中的解冻方式进行花粉解冻，用1.2.1中最佳花粉活性检测方法进行花粉活性检测，筛选出最佳的-20℃和-80℃贮藏解冻方法。

1.2.4 数据统计

实验数据的显著性检验采用SPSS. 19.0，统计分析使用Excel 2016。

2 结果与分析

2.1 花粉活性检测方法筛选

各检测方法结果如表2所示。3种姜属植物新鲜花粉的TTC染色法不能成功让花粉染上颜色，故该方法不能作为测定这3种姜属植物花粉活性的方法。在培养基法中，光果姜花粉的最佳培养基组合为：8%蔗糖+0.03% H3BO3；珊瑚姜花粉的最佳培养基组合为：5%蔗糖+0.04% H3BO3；红球姜花粉的最佳培养基组合为：5%蔗糖+0.01% H3BO3。而3种花粉的培养基法结果远低于柱头涂抹法，有显著性差异，故不能准确测定花粉活性。

将这3种花粉的MTT染色法和联苯胺染色法结果与柱头涂抹法进行对比，光果姜花粉的联苯胺染色法与柱头涂抹法的结果有显著性差异，MTT染色法与柱头涂抹法的结果较为接近，故光果姜花粉活性的最佳检测方法为MTT染色法。珊瑚姜花粉的MTT染色法和联苯胺染色法分别与柱头涂抹法的结果无显著差异，但MTT染色法的标准差较联苯胺染色法低，说明MTT染色法的结果较稳定，所以珊瑚姜花粉活性的最佳检测方法为MTT染色法。红球姜花粉的MTT染色法和联苯胺染色法与柱头涂抹法的结果无显著差异，但MTT染色法的标准差较低，所以红球姜花粉活性的最佳检测方法为MTT染色法。

综上所得，MTT染色法为3种姜属植物花粉活性检测最佳方法。

2.2 3种姜属植物常温下的花粉活性变化的结果

试验结果如图1显示，光果姜花粉活性第1天达（92.13±1.56）%，花粉活性每天逐渐降低，5 d后已完全失去活性；珊瑚姜花粉活性第1天高达（92.36±1.44）%，2 d后已降至（43.39±5.12）%，3 d后已完全失去活性；红球姜花粉活性第1天为（86.30±3.28）%，2 d后花粉活性下降7成，降至（11.25±1.13）%，3 d后已完全失去活性。

综上，3种姜属植物在刚开花时花粉活性较高，花粉活性随放置时间的延长而降低，光果姜花粉常温下的放置时间较其余2种花粉时间长。

2.3 低温条件下不同解冻方法对3种姜属花粉活性的影响

由表3可知，光果姜花粉在-20℃贮藏30 d后取出，室温放置10 min后花粉活性最高，为（48.33±5.33）%。珊瑚姜花粉在直接取出后检测，花粉活性为（19.67±4.23）%，其余解冻方法的花粉活性均为0。红球姜花粉在贮藏30 d后花粉活性为0，没有进行解冻方法筛选的必要。

根据表4可知，3种花粉均-80℃贮藏30 d后，直接取出马上进行花粉活性检测，测得的花粉活性最高。光果姜花粉除了-20℃ 1.5 h →4℃ 1.5 h →室温 0.5 h外，其余方法的结果与直接取出方式无显著差异。珊瑚姜花粉水浴35℃ 5 min后活性与直接取出无显著差异，其余方法的结果均与直接取出有显著性差异。红球姜花粉的其余解冻方法比直接取出低约40%，均不利于花粉活性的保存。

2.4 不同贮藏条件对3种姜属植物花粉活性的影响

由图2可以看出，无论在哪种条件下，3种姜属花粉活性随着贮藏时间的延长呈明显的下降趋势。在室温干燥、4℃不干燥和4℃干燥贮藏30 d后，3种姜属花粉已完全失去活性，说明这几种条件不适宜花粉的贮藏。

光果姜贮藏情况如图2-A所示，在-20℃不干燥与-20℃干燥条件下贮藏，花粉在90 d后完全失去活性。在-80℃不干燥与-80℃干燥条件下贮藏，花粉在120 d后活性降为0。贮藏30 d后，花粉活性的大小顺序为：-80℃不干燥>-80℃干燥>-20℃干燥>-20℃不干燥，-80℃不干燥与-80℃干燥2种贮藏方式仍能保持较高的活性，4种贮藏方法的结果均有显著性差异。贮藏60 d后，花粉活性的大小顺序为： -80℃干燥>-80℃不干燥>-20℃干燥>-20℃不干燥，-80℃干燥与-80℃不干燥2種方法的结果无显著性差异，与其余2种方法均有显著性差异。

由图2-B可知，在-20℃不干燥、-20℃干燥、-80℃不干燥和-80℃干燥条件下贮藏，珊瑚姜花粉在60 d后完全失去活性。贮藏30 d后，花粉活性已低于50%，花粉活性的大小顺序为：-80℃干燥>-80℃不干燥>-20℃干燥>-20℃不干燥，-80℃干燥与-80℃不干燥2种方法之间的结果无显著性差异，-20℃干燥与-20℃不干燥之间的结果无显著性差异。

红球姜贮藏情况结果显示（图2-C）：在-20℃贮藏30 d后，不干燥的花粉活性为0，干燥的花粉活性只有（2.36±0.86）%。所以-20℃的贮藏条件也不适于红球姜花粉贮藏。在-80℃不干燥和-80℃干燥条件下贮藏，花粉在60 d后完全失去活性。贮藏30 d后，-80℃不干燥的花粉活性大于70%，高于-80℃干燥的花粉活性，2种贮藏方法的结果有显著性差异。

综上，低温有助于花粉活性的保存，花粉活性随贮藏时间的延长而降低；光果姜花粉和红球姜花粉的最佳贮藏方法为-80℃不干燥，珊瑚姜花粉最佳贮藏方法为-80℃干燥。

3 讨论

用培养基培养花粉进行离体萌发的方法，是根据花粉的萌发率来判定花粉的活性情况[11]。这种方法可以完全定量，且与许多植物的结实和种子形成具有相关性，是许多杂交育种中花粉活性测定的首选方法[9]。但该方法对培养条件比较敏感，当培养条件稍微改变时，测定结果会相差悬殊[12]。在本试验中3种姜属植物用培养基法测定的花粉活性结果与其余方法相差较大，且远低于柱头涂抹法，说明该方法不适用于测定这3种姜属植物的花粉活性。芦娟等[13]在对油橄榄花粉进行离体培养的时候也出现相似的结果。

各种染色法测定花粉活性，其实是测定花粉的营养物质或代谢情况[14]，以此判断花粉的活性，而不是直接表现花粉的萌发情况。所以只有与花粉在柱头上的萌发率进行对比结果相一致的情况下才可以运用。TTC染色法是根据花粉中呼吸酶的活跃情况来判定花粉活性的强弱[13]。但在本试验中，该染色法的有活性花粉与无活性花粉的颜色差别不明显，所以该方法不适合用于测定这3种姜属植物花粉活性。TTC染色法不能使花粉成功着色，同样在爪叶菊花[15]、辣椒[16]、梨[14]中也出现相类似的结果。联苯胺染色法是根据过氧化物酶的活性来判断花粉的活性[17]，该方法简便迅速[11]，但试验中过氧化氢分解有气泡产生，会影响观察，导致实验结果受影响。MTT染色法是根据花粉中脱氢酶的活性来判断花粉的活性[18]。该方法用时较短，染色结果清晰容易区别，且与柱头涂抹法的结果最为接近，所以该方法为测定这3种姜属植物花粉活性的最佳方法。

3种姜属植物花粉在常温下花粉活性会随时间的延长而降低，这是由于花粉会进行呼吸作用消耗自身贮藏的能量[19]，当能量消耗完毕且没有补充花粉生长所需的营养物质，花粉则会完全失去其活性。

影响花粉活性最重要的环境因素是温度和相对湿度[20]。控制这2个因素，最大限度地降低花粉的代谢水平，使花粉处于休眠状态，这是延长花粉活性的基本原则[7]。在本试验中，3种姜属植物的花粉在不同温度条件下进行贮藏，贮藏温度越低，花粉活性保存得越好，他人的研究也表明，温度与花粉贮藏寿命呈负相关性，温度越低，花粉贮藏寿命越长[21]。大概是因为温度升高会增强花粉内部的呼吸强度，导致花粉的营养消耗[22]。光果姜和红球姜花粉在-80℃条件下干燥贮藏30 d的活性比不干燥的低，说明这2种花粉在贮藏过程中不能过于干燥。在一定范围内，相对湿度与花粉贮藏寿命也呈负相关性，可使花粉代谢受到抑制而使花粉贮藏寿命延长[23]，但极干燥的条件也不利于花粉保存。有研究表明，很多物种花粉在贮藏时含水量不能低于40%[24]。但珊瑚姜花粉在-80℃条件在干燥贮藏30 d的活性较高，说明不同种之间对干燥贮藏条件的要求有差异。

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