纳米Cu2O-还原石墨烯复合修饰玻碳电极用于多巴胺的检测

贺全国，李广利,*，刘 军，刘晓鹏，梁 静，邓培红*

（1.湖南工业大学生命科学与化学学院，湖南 株洲 412007；2.衡阳师范学院化学与材料科学学院，湖南 衡阳 421008）

人类食用含多巴胺（dopamine，DA）残留的畜产品和海产品会因DA含量过高引发食物中毒。尽管DA已禁止在饲料和动物饮用水中使用，但非法使用情况仍屡见不鲜，因误食残留DA的食品引发的中毒事件时有发生。此外，DA含量的异常会引起帕金森和精神分裂症等难治愈的神经系统类疾病[1]。因此检测人血清中DA含量对食品安全（如食品中毒物快速鉴定）和医学临床诊断方面具有重要意义。相对于高效液相色谱法、荧光光度法、化学发光法等方法，电分析方法具有简便快速、成本低、灵敏度高等特点，且无需大型仪器设备，已广泛应用于DA的检测[2-3]。但DA、抗坏血酸（ascorbic acid，AA）、尿酸（uric acid，UA）共存于中枢系统细胞外液和血清中，在裸电极上三者的氧化峰电位接近，从而干扰DA的测定[4-5]。目前，化学修饰电极已成为解决这一问题的常用方法，金属纳米粒子修饰电极[6-7]、聚合物修饰电极[8]、碳纳米管及其复合物修饰电极[9-11]、石墨烯及其复合物修饰电极[12-16]等均有报道。

纳米Cu2O材料是一种环境友好的P型半导体材料，其特殊的电子结构使Cu2O具有很多优良的性能，广泛应用于太阳能电池[17]、光催化[18]和传感器[19]等领域。受纳米Cu2O材料分散性差的影响，单一纳米Cu2O材料修饰电极难以用于药物和生物分子的电分析。自2004年被发现以来，石墨烯因其具有优异的导电性、高比表面积和良好的生物相容性等优势，广泛应用于电分析领域。近年来，国内外学者发展了Cu2O/石墨烯复合修饰电极技术。如Zhou Danling[20]、Mei Liping[21]等发展了纳米Cu2O/还原氧化石墨烯复合修饰玻碳电极，对葡萄糖的检测表现出优异的催化活性和良好的选择性。Jiang Binbin等[22]制备了纳米Cu2O/氮掺杂石墨烯修饰玻碳电极，用于测定H2O2，具有较宽的线性范围和低的检出限。然而Cu2O复合石墨烯材料修饰玻碳电极测定DA鲜见报道。由于纳米Cu2O相对于贵金属纳米粒子如Pt、Au成本更低，且制备简单，倘若能采用Cu2O/石墨烯修饰电极检测DA，将是非常有意义的尝试。

电化学还原方法是一种绿色方法，无需使用强还原剂，反应温和可控[23]。实验室曾利用电化学还原法发展石墨烯及其复合物修饰的乙炔黑碳糊电极，成功用于色氨酸等生物活性物质和多酚A等添加剂的电化学检测[24-27]。本实验采用电化学还原方法制备纳米Cu2O/还原石墨烯复合修饰电极（Cu2O-reduced graphene oxide nanocomposite modified glass carbon electrode，Cu2ORGO/GCE），进一步探索和优化电化学还原条件和电分析测试条件，并深入研究DA在复合修饰电极表面的电化学行为，最后将其应用于DA样品的检测。希望利用纳米Cu2O与还原石墨烯的协同作用，充分发挥Cu2O良好的电催化活性和还原石墨烯的高比面积、较强的表面吸附能力等优势，从而提高DA检测的选择性、灵敏度和线性范围。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

DA 美国Fluka公司；其余化学试剂均为国产分析纯。所有溶液均用超纯水（18.2 MΩ）配制。血清样来自于株洲市人民医院。

1.2 仪器与设备

S-3000N扫描电镜（scanning electron microscope，SEM，带有EMAX能谱仪） 日本Hitachi公司；JP 303极谱分析仪 成都仪器厂；CHI660E电化学工作站 上海辰华仪器厂；X-射线粉末衍射（X-ray powder diffractometer，XRD）仪 日本理学（Rigaku）公司。

1.3 方法

1.3.1 纳米Cu2O粒子、氧化石墨烯（graphene oxide，GO）及Cu2O-GO复合材料制备

取50 mg CuSO4·5H2O和24 mg聚乙烯吡咯烷酮溶解在10 mL的超纯水中，在超声作用下搅拌30 min，形成透明的溶液。将2 mL 0.2 mol/L NaOH溶液加入到上述透明溶液中，室温下持续搅拌30 min，得到蓝色沉淀Cu(OH)2。最后加入6 μL水合肼，室温下持续搅拌20 min，得到砖红色悬浮物，5 000 r/min离心，取其沉淀物即为Cu2O。经多次纯水和乙醇清洗后，再将其配制成1 mg/mL的纳米Cu2O粒子水溶液。

GO采用改进的Hummers方法[28]制备：先将23 mL浓H2SO4冷却至0 ℃，将0.5 g石墨粉和0.5 g NaNO3加入到以上冷却的浓H2SO4中，机械搅拌均匀；冰水浴控制温度低于5 ℃，搅拌缓慢加入3 g KMnO4；接着升温至35 ℃，搅拌2 h，形成糊状物；温度控制在50 ℃以下，慢慢加入40 mL H2O，然后升温至95 ℃反应0.5 h；随后加入100 mL H2O，并将以上混合溶液分几次搅拌加入到20 mL 30% H2O2溶液中，得到金黄色溶液；趁热抽滤，先用150 mL盐酸溶液洗，再用150 mL H2O清洗，最后取滤纸及其上面的固体50 ℃真空干燥，得到GO。将上述100 mg干燥的GO分散在100 mL蒸馏水中，超声剥离2 h，离心2 次，除去沉淀物，取上层清液，得质量浓度约为1 mg/mL金黄色GO溶液。将1 mL纳米Cu2O粒子（1 mg/mL）分散液加入到20 mL上述GO溶液中，超声分散2 h，得Cu2O-GO分散液。

1.3.2 Cu2O-GO/GCE的制备

分别用粒径为1.0、0.3 μm和0.05 μm的α-Al2O3对玻碳电极（glassy carbon electrode，GCE）进行抛光，依次将电极置于超纯水、无水乙醇、超纯水中超声1 min，用高纯氮气吹干。采用滴涂的方式将Cu2O-GO分散液修饰在GCE表面，在红外灯下烤干。最后利用电化学方法还原成石墨烯，即可制得Cu2O-RGO/GCE。

1.3.3 电化学实验

在磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer solution，PBS）中加入不同量的DA，配制10 mL不同浓度DA溶液，测量前先通N2除氧。采用循环伏安法进行电极电化学性能测定。采用二阶导数线性伏安法对DA测定，检测前先在一定的富集电位下富集。电化学实验采用标准三电极体系：裸电极、RGO或Cu2O-RGO修饰电极为工作电极，铂电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极。循环伏安法在CHI 660E电化学工作站进行，二阶导数线性伏安法则在JP-303E型极谱分析仪进行。

1.4 数据处理

首先测定不同检测条件（pH值、富集电位和富集时间）下氧化峰电流，得到最佳的检测条件。然后在最佳检测条件下采用二阶导线线性扫描伏安法测定不同浓度标准溶液的氧化响应峰，用Origin 9.0软件绘制标准曲线并进行线性拟合，得到线性方程。然后采用标准加入法测定真实样品的氧化响应峰电流，根据线性方程，计算样品浓度的测定值。

2 结果与分析

2.1 微观形貌表征

图1 R G O（A）、C u 2 O（B）及C u 2 O-R G O（C）S E M图F i g. 1 S E M i m a g e s o f R G O, C u 2 O a n d C u 2 O-R G O

图2 Cu2O纳米粒子的XRD谱图Fig. 2 XRD patterns of three different morphologies of Cu2O

由图1可知，RGO为薄层弯曲绵延起伏状态（图1A），纳米Cu2O纳米颗粒呈正方体形状，大小均一，粒径约为150 nm（图1B）。从图1C可以清楚地看到RGO薄层覆盖在纳米Cu2O粒子表面，并呈絮状起伏状态，说明RGO与纳米Cu2O粒子结合较好。图2为纳米Cu2O的XRD图谱。对比Cu2O标准衍射卡（JSPDS78-2076）发现，纳米Cu2O与标准卡衍射峰相吻合（虚线表示Cu2O标准卡上对应的衍射峰），这表明已成功制备立方相的Cu2O纳米材料。

2.2 电化学还原条件优化结果

图3 电化学过程还原电位和还原时间优化Fig. 3 Optimization of reduction potential and reduction time for electrochemical reduction

电化学还原氧化石墨烯的电位一般在-1.5～-1.0 V。固定还原时间300 s，分别在不同还原电位（-1.7、-1.5、-1.2、-1.0、-0.8 V）制备复合修饰电极。如图3所示，当还原电位为-1.5 V时，DA（1×10-5mol/L）在复合修饰电极氧化峰电流ipa最大。固定还原电位为-1.0 V，分别在不同还原时间（60、120、180、240、300 s和360 s）下制备修饰电极。如图3所示，60～300 s峰电流ipa随还原时间延长而增大，300 s达到最大值，随后峰电流保持稳定。综上所述，制备Cu2O-RGO/GCE修饰电极的最佳还原条件为还原电位-1.5 V，还原时间300 s。

2.3 电化学性能表征

图4 裸电极、RGO或Cu2O-RGO修饰电极在5 mmol/L K3Fe(CN)6溶液中的循环伏安图（A）和Nyquist图（B）Fig. 4 Cyclic voltammograms (A) and Nyquist plots (B) of bare electrode,and RGO or Cu2O-RGO modi fi ed electrode at 5 mmol/L K3Fe(CN)6

图4A为裸GCE、RGO/GCE、Cu2O-RGO/GCE在5 mmol/L Fe(CN)63-/4-溶液中的循环伏安曲线，3种电极的还原峰电流ipc分别为8.808×10-5、1.187×10-4、1.311×10-4A。根据Randles-Sevcik方程计算，得到裸的GCE、RGO/GCE或Cu2O-RGO的有效电活性面积分别为0.075、0.101 cm2和0.112 cm2。裸电极的电化学活性面积计算值与实际几何面积（Φ 3.0 mm，0.071 cm2）相符。RGO/GCE、Cu2O-RGO/GCE分别为裸电极的1.3 倍和1.5 倍，这与石墨烯和纳米Cu2O具有高的比表面积密切相关。电化学活性面积的增大不仅有利于工作电极富集吸附更多的DA，同时还增加修饰表面的催化位点，可以加速催化DA的氧化还原反应。还采用电化学阻抗谱研究了电极界面性质，结果如图4B所示。Nyquist图半圆半径大小代表电子传递电阻（Rct），电子传递电阻RGO/GCE略小于Cu2O-RGO/GCE，两者明显小于裸GCE电极。这主要是由于石墨烯具有高的导电性能，而Cu2O为半导体，这很好地解释了Cu2O-RGO/GCE的Rct略大于RGO/GCE。

2.4 DA在不同修饰电极上的循环伏安响应

在0.1 mol/L PBS中，不同修饰电极在1×10-5mol/L DA溶液中的循环伏安图如图5所示。DA在裸GCE上的响应电流最小（ipa=5.415 μA，ipc=3.899 μA），氧化还原峰矮而宽。DA在RGO/GCE的氧化还原峰电流有了较大提高（ipa=36.565 μA，ipc=31.149 μA），可能原因为：1）RGO比表面积大，增加了电化学活性面积；2）RGO与待测物DA通过π-π相互作用，增强了DA在电极表面的吸附能力。DA在Cu2O-RGO/GCE的氧化还原峰电流最大（ipa=70.720 μA，ipc=51.558 μA），且峰形比较尖锐。这主要是由于RGO与纳米Cu2O的协同作用：RGO导电性良好、比表面积大，增强了电化学活性面积和DA吸附；Cu2O对DA存在的电催化作用，即偶合了Cu+/Cu2+氧化还原反应，促进电子在电极表面的快速传递，从而提高了DA的氧化还原峰电流[29]。

图5 不同电极在含1×10－5 mol/L DA的0.1 mol/L PBS（pH 3.5）中的循环伏安图Fig. 5 Cyclic voltammograms of different electrodes in 0.1 mol/L PBS containing 1 × 10–5 mol/L DA (pH 3.5)

2.5 测定条件的优化结果

2.5.1 介质pH值的影响

分别考察DA在pH 2.0～5.5的PBS中的循环伏安行为。如图6A所示，当pH 3.5时，DA的响应电流峰最大。故测定pH值优选3.5。此外还发现在pH 2.0～5.5的PBS中，DA的氧化峰电位与pH值呈线性关系，线性方程为y=-0.063 14x+0.542 0（R2=0.984），斜率为-63 mV/pH，非常接近理论值-59 mV/pH，这表明DA的电化学氧化是等电子等质子过程[30]。

图6 介质pH值及富集条件的影响结果Fig. 6 Effects of medium pH value and enrichment conditions

2.5.2 富集条件的影响

研究-0.3～0.2 V不同富集电位下的溶出曲线，发现溶出峰电流大小与富集电位密切有关。从-0.3～-0.1 V随富集电位变正，溶出峰电流先增大；富集电位超过-0.1 V后，电位变正，峰电流逐渐降低（图6B）。因此选用-0.1 V作为富集电位。如图6B所示，改变富集时间，从30～150 s随富集时间的延长，溶出峰电流增大；富集时间大于150 s后，富集时间延长，峰电流基本保持不变。因此选用150 s为测定富集时间。综上所述，富集条件优选富集电位-0.1 V、富集时间150 s。

2.5.3 扫描速率的影响

在pH 3.5、0.1 mol/L PBS中，扫描速率在30～300 mV/s范围，1×10-5mol/L DA溶液在Cu2O-RGO/GCE修饰电极上的循环伏安图如图7A所示。随着扫描速率的增加，背景电流显著增加，且DA的氧化还原峰电流也随之增加；由图7B发现，DA的氧化峰电流（ipa）与还原峰电流（ipc）与扫描速率（v）在30～300 mV/s之间存在良好的线性关系，线性方程分别为ipa=-0.026 8v-0.478 3（R2=0.990），ipc=0.033 9v+0.674 2（R2=0.998）。这表明DA在Cu2O-RGO/GCE修饰电极上的反应受吸附过程控制[4]，因此后续实验采用富集方法增大电流响应信号。尽管随着扫描速率的增大峰电流不断增大，但背景电流也会相应增大。因此过高的扫描速率不适合测量峰电流，DA定量检测扫描速率选择100 mV/s。随着扫描速率的增加，氧化峰电位正移，还原峰电位负移，并与扫描速率的对数（lnv）呈良好的线性关系（图7C）。氧化还原峰电位与扫描速率的对数线性方程分别为Epa=0.042 4lnv+0.492，Epc=-0.029 5lnv+0.199。结合Lavrion方程[33]公式（1）、（2）与上述Epa/Epc-lnv线性方程的斜率，即可得电荷转移系数α为0.6，电子转移数n=0.74≈1。将其代入公式（3），即可计算异相电子转移速率为1.65 s-1。结合2.5.1节可知，修饰电极Cu2ORGO/GCE在pH 3.5的PBS测定DA属于1电子1质子快速传递过程，其ks值大于文献报道值0.74 s-1[32]。

式中：E0’为电势值/V；Epa和Epc分别表示氧化峰电位和还原峰电位/V；v为扫描速率/（V/s）；α为电荷转移系数；ks为异相电子转移速率/s-1；n为电子转移数；T为开尔文温度；F为法拉第常数（96 480 C/mol）；R为摩尔气体常数（8.314 J/（mol·K））；D为扩散系数/（cm2/s）；ΔEp为电位差/V。

图7 电流与扫描速率关系图Fig. 7 Effect of scan speed on the peak current

2.6 抗干扰测试结果

人体中同时共存DA、AA和UA三种相似的物质，容易对DA检测造成干扰。采用线性溶出伏安法，考察DA（1×10-5mol/L）与AA（1×10-5mol/L）、UA（1×10-5mol/L）共存时电流响应。结果如图8所示，DA、AA、UA三者的氧化峰电位得到了有效分离，P0、P1、P2代表AA、DA和UA的峰电位，AA-DA氧化峰电位差ΔEp为204 mV，DA-UA之间的ΔEp为144 mV。且与单独测定DA相比，峰电流未见明显减少。这说明石墨烯和Cu2O纳米粒子两者的协同效应提高了选择性和抗干扰能力。

图8 DA、AA与UA混合液在Cu2O-RGO/GCE上线性扫描溶出伏安图Fig. 8 Linear sweep stripping voltammograms at Cu2O-RGO/GCE in a mixture of DA

2.7 线性范围与检出限

在优化条件下，采用线性伏安法对DA进行定量分析。如图9A所示，当DA浓度为1×10-8～1×10-6mol/L时，氧化峰电流ipa均随浓度增大而增大，并呈现良好的线性关系，线性方程为ipa=13.348c+3.839（R2=0.992）。当DA浓度为1×10-6～8×10-5mol/L时，浓度与峰电流同样呈线性关系（图9B），线性方程为ipa=0.743 1c+19.125（R2=0.970）。式中：ipa为峰电流/μA；c为多巴胺的浓度/10-6mol/L。检出限（RSN=3）为6.0×10-9mol/L。这一研究结果比文献[15,33-37]报道的线性范围更宽，仪器检出限更低（表1）。

图9 DA氧化峰电流与浓度的关系图Fig. 9 Relationship between oxide peak ipa and DA concentration within the ranges of 1 × 10–8–1 × 10–6 mol/L and 1 × 10–6–8 × 10–5 mol/L

表1 Cu2O-RGO/GCE检测DA效果与文献报道的结果对比Table 1 Comparison of dopamine detection using Cu2O-RGO/GCE and modi fi ed electrodes reported in the literature

2.8 样品检测结果

将一支盐酸多巴胺注射液（标示质量浓度为10 g/L）定容至100 mL容量瓶中，再移取一定量的稀释液，置于另一10 mL容量瓶中，用pH 3.5的0.1mol/L PBS稀释至刻度，按上述实验方法测定。测定结果见表2，DA样品测定值与标示值基本相符，相对标准偏差为-3.20%～1.12%，回收率为96.5%～104.4%。这表明Cu2O-RGO/GCE能用于外源性实际样品的检测。为说明可用于内源性DA的检测，取1 mL的血清，用pH 3.5、0.1 mol/L PBS和一定量的DA标液配成10 mL检测溶液。所得结果见表3，从回收率可以发现修饰电极可用于血清中DA的检测。

表2 盐酸多巴胺针剂的测定结果（n=4）Table 2 Determination of dopamine in injection (n= 4)

=3）Table 3 Determination of dopamine in serum (n= 3)表3 血清中DA测定结果（n

3 结 论

本实验通过电化学还原法制备Cu2O-RGO/GCE修饰电极，得到最佳还原条件为：还原电位-1.5 V，还原时间120 s。通过电镜观察到RGO均匀地覆盖在纳米Cu2O颗粒表面，说明RGO与纳米Cu2O颗粒结合较好。通过循环伏安法对DA在Cu2O-RGO/GCE的电化学行为进行研究，表明DA在修饰电极表面的反应为1电子1质子过程，并受吸附控制。AA和UA对等量的DA在Cu2ORGO/GCE表面产生的峰电流并没受到明显影响，显示修饰电极对DA的测定具有较好稳定性和选择性。该修饰电极可应用于血清中内源性DA的检测和外源DA（盐酸多巴胺注射液）的检测，表明该修饰电极可实际应用于DA的定量检测。