枣花及枣花蜜香气成分分析

敖常伟，吕 姗，吴香菊，赵智慧，刘孟军,*

（1.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071000；2.河北农业大学中国枣研究中心，河北 保定 071000）

枣属（Ziziphus Mill）是鼠李科（Rhamnaceae）植物50多个属中经济价值最高的一个属[1]。我国的枣树大致分布在东经76°～124°、北纬23°～42°范围内，是我国分布最为广泛的果树品种之一，也是我国的优势树种，其产量（占世界99%）位居干果产量中的第1位[2]。枣树五月开花，花期一直延续到七月，花量大，泌蜜丰富，是北方主要的蜜源植物[3]，枣花呈黄绿色，个体较小，花中有蜜盘，花蜜在蜜盘上积聚成滴，晶莹如珠，香气浓郁，气味独特，是典型的虫媒花。蜜蜂采集枣花蜜盘中的花蜜，与自身分泌物结合后经转化、脱水，在蜂巢中酿造成熟后形成天然甜味物质即为枣花蜜，具有特有的枣花香气[4]。前人关于枣花香气成分的研究多集中于沙枣花，丁佳雯等[5]采用水蒸气蒸馏法、固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）法、顶空采集法和气囊采集法提取并鉴定了沙枣花的挥发性成分。杨虎等[6]采用超临界CO2萃取法萃取了沙枣花精油并对其进行了分析鉴定；有关沙枣花的系列研究还有很多，但沙枣花是枣花中的特殊品种，并不具有代表性。另外本课题组成员也曾经对选取的不同品种枣花的香味成分进行了分析鉴定，卢愿[7]对赞皇大枣、金丝小枣、冬枣3 个品种的枣花挥发性成分进行探究；陈奇奇[8]选取了9 个具有代表性的枣花品种，采用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法对其挥发性成分进行了分析鉴定；但由于当时实验方法和仪器设备的限制条件，对枣花挥发性物质的提取以及成分的鉴定方法研究不够深入，多局限于对挥发性成分的笼统定性，并未与嗅觉分析相结合，缺乏对枣花香味物质进行系统性的研究。同时，鲜见国外研究学者关于枣花香气成分的研究报道。另外当前市面销售的枣花蜜种类很多，但目前缺乏能准确快速鉴定是否真的来源于枣花的方法，如果能建立枣花与枣花蜜香味成分的联系，对今后建立准确判别枣花蜜真假的鉴定方法将具有重要意义。

SPME是集采集、富集浓缩、进样于一体的无溶剂的样品前处理方法，通常与GC、GC-MS、液相色谱、液相色谱-质谱等仪器联用[9]。气相色谱-质谱-嗅觉（gas chromatography-mass spectrometry-olfactometry，GC-MS-O）法是将GC的分离能力与人灵敏的嗅觉结合起来对香味活性成分进行鉴定，可以弥补单独MS鉴定的不足[10-11]。当前相关学者采用SPME结合GC-MS联用技术对植物中各种挥发性成分的分离和鉴定进行了大量研究。谢超等[12]采用顶空SPME结合GC-MS对3 个不同品种的樱桃香气成分进行分析鉴定，发现酸类和酮类物质随着果实不断成熟含量逐渐增加，烃类物质含量不断下降，乙醇含量上升，而（Z）-2-己烯醇含量逐渐下降。王长锋[13]采用GC-MS分析贮藏温度对红肉脐橙果皮香气成分的影响，结果表明贮藏温度对α-蒎烯、β-水芹烯、正辛醇的生成和降解影响明显，还会改变辛醛与橙花醇的生成与降解途径。González-Cebrino等[14]采用顶空SPME法研究了高压处理对梅子香气成分的影响。Riu-Aumatell等[15]采用GC-MS-O法研究了几种果汁的香气成分，发现该方法可以快速有效地区分调配果汁与天然果汁。贾媛等[16]采用GC-MS联用仪对香茅精油化学成分进行分析鉴定，共分离出29 种组分。罗静等[17]采用顶空SPME法提取4 个品种的桃成熟果肉中的挥发性成分，并用GC-MS联用仪对其进行测定，4 份桃种质中共鉴定出116 种挥发性成分，明确了桃香味物质的主要构成成分。杨秀莲等[18]采用顶空SPME结合GC-MS技术对3 个四季桂品种盛花期花瓣的挥发性化学成分进行了分析，并比较了鲜花与短期超低温冰箱保存后花瓣挥发性成分的差异，结果表明，不同四季桂品种的香味主体成分比较接近，主要成分为β-紫罗兰酮、二氢-β-紫罗兰酮、顺-芳樟醇氧化物（呋喃型）等物质。类似研究较多，这也说明利用现代仪器分析鉴定手段对植物的花香成分进行研究是当前国内外的发展趋势。

本研究选择顶空SPME结合GC-MS-O法，以常见婆枣的枣花为分析对象，比较不同阶段枣花的香气成分差异，枣花与枣花蜜香气成分的关联，旨在充分了解枣花及枣花蜜的香气成分的组成及变化，为今后开发类似枣花香精提供理论依据，另外也为市面上真假枣花蜜的鉴定提供技术参考。同时，建立一套系统的枣花香气成分提取、分离、定性和定量的方法，为今后枣的利用及枣相关产品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枣花原料采摘于河北省保定市河北农业大学枣标本园的婆枣，枣花蜜购于河北农业大学枣标本园内放蜂的蜂农，确保该蜂蜜来源于枣花。

C5～C30正构烷烃标准品 美国Accustandard公司。

1.2 仪器与设备

7890B-5977A型GC-MS联用仪、HP-Innowax毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国Agilent公司；ODP3型嗅闻仪 德国Gerstle公司；85-2A磁力加热搅拌器 常州朗越仪器制造有限公司；SPME手动进样手柄 美国Supelco公司；20 mL螺口顶空瓶（含PTFE硅胶垫和螺纹金属盖） 杰岛生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香气成分的萃取

采取顶空SPME法对枣花挥发性成分进行萃取。将装有样品的顶空瓶置于40 ℃水浴中预热平衡10 min。然后将活化好的萃取头插入20 mL样品瓶（活化条件根据萃取头的不同严格按照萃取头附带的活化指南进行），温度40 ℃，萃取时间40 min，进样口温度240 ℃，解吸时间8 min。为使SPME所得到的挥发性组分更具代表性，考察4 种常用的SPME纤维头[11-12]：50/30 μm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS，样品添加量（1、2、3、4 g），萃取温度（30、40、50、60 ℃），萃取时间（30、40、50、60 min），解吸时间（2、4、6、8、10 min）5 个影响因素，评价指标为总峰面积和数量，平行处理3 次。

参考任佳淼[19]对枣花蜜进行前处理及萃取。枣花蜜20 g，加入0.7 mL去离子水和0.4 g NaCl，混匀，密封。采用50/30 µm DVB/CAR/PDMS于70 ℃萃取50 min。

1.3.2 GC条件

色谱柱：HP-Innowax毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 µm）；升温程序：50 ℃保持1 min，以7 ℃/min升至250 ℃，保持13 min；载气（He）流速1.45 mL/min；进样口温度240 ℃；不分流。

1.3.3 MS条件

电子电离源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；采集类型：全扫描；质量扫描范围m/z 33～350；辅助加热器温度250 ℃。

1.3.4 嗅闻仪条件

辅助气N2，传输线温度250 ℃。实验时选择3 人对样品进行嗅闻分析，同一种物质被2 人以上嗅闻到并且有相似嗅觉描述时，其结果可被计入最终数据分析。通过预实验结果分析，选择4 种气味明显的化合物，分别为醋酸、正己酸、糠醛、5-羟甲基糠醛，将这4 种化合物标准品用二氯甲烷分别释至50、100、500、1 000 µg/mL，嗅闻人员应事先以这4 种标准品进行嗅闻训练，记录闻到气味的时间，嗅闻时间比保留时间大约滞后0.1 min，并通过训练熟悉掌握嗅闻仪的使用。

1.3.5 定性及定量分析

各组分与NIST 14标准谱库进行对照分析，匹配度不小于80%的计入结果，保留指数（retention index，RI）根据相同色谱条件下C5～C30正构烷烃标准品对各组分的保留时间进行计算，用匹配度及RI定性，采用峰面积归一法计算各组分相对含量。

2 结果与分析

2.1 SPME条件优化

2.1.1 萃取头的选择

不同萃取纤维表面涂渍有不同性质的固定相涂层，这些固定相涂层对不同化合物具有一定的富集效果，萃取纤维涂层是影响萃取选择性和灵敏度的关键因素[20]。如图1所示，比较4 种类型的萃取纤维对枣花挥发性成分的萃取效果（以总峰面积评价吸附量，总峰数量评价化合物种类）。4 种不同萃取纤维[21-22]所得挥发性成分的总峰面积及数量均存在显著性差异。其中50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取效果最好（化合物数量及总峰面积最大），综合考虑选择50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纤维。

图1 萃取纤维类型对SPME效果的影响Fig. 1 Effect of fi ber types on the extraction efficiency of SPME

2.1.2 样品添加量的选择

图2 样品添加量对SPME效果的影响Fig. 2 Effect of sample amounts on the extraction efficiency of SPME

顶空体积是影响待测物吸附量的重要因素，枣花体积不易测定，因此可以通过调节枣花添加量来控制顶空体积。如图2所示，峰面积随样品添加量的增加而增加，当样品添加量超过2 g时，所得挥发性成分种类并无显著性增加，当样品添加量达到4 g时，挥发性物质种类减少，可能是顶空体积较小导致的。样品添加量超过3 g时，吸附量达到平衡。样品添加量过多会减小顶空体积，操作时萃取纤维暴露于顶空部分，且萃取纤维具有一定长度，体积过小不仅不利于香气成分的挥发，还会使样品接触萃取头，引起萃取头污染，也会增加操作难度。因此，添加3 g枣花较合适。

2.1.3 萃取温度的选择

如图3所示，萃取温度为30、40、50 ℃时对挥发性物质种类影响不显著，但60 ℃与之相比差异显著，40、50、60 ℃时挥发物质吸附量差异不显著，但与30 ℃相比差异显著，升高萃取温度可以提高挥发性物质在顶空体积中的浓度，促进萃取达到动态平衡，但过高温度容易导致枣花香气失真，综合考虑， 40 ℃萃取平衡较为合适。

图3 萃取温度对SPME效果的影响Fig. 3 Effect of extraction temperature on the extraction efficiency of SPME

2.1.4 萃取时间的选择

图4 萃取时间对SPME效果的影响Fig. 4 Effect of extraction time on the extraction efficiency of SPME

如图4所示，萃取所得化合物种类和吸附量随时间延长呈上升趋势。在萃取的初始阶段吸附量增加迅速，直至达到平衡，而继续延长萃取时间吸附量和种类不再有明显的变化吸附纤维达到平衡。萃取30 min与40 min所得总峰面积并无显著性差异，萃取50 min与30、40 min相比吸附量显著增加。说明适当延长萃取时间有助于富集较多的挥发性物质，但由于枣花为鲜样，长时间保持加热状态容易萎蔫，使香气失真。综合考虑，萃取50 min较为适宜。

2.1.5 解吸时间的选择

图5 解吸时间对解吸效果的影响Fig. 5 Effect of desorption time on the desorption efficiency

实验过程中发现解吸时间对吸附量和种类影响较为显著，一方面，解吸时间不足使解吸不彻底，从而导致物质在萃取纤维表面的残留，使检测结果不具代表性，甚至污染后续样品，另一方面，萃取纤维长时间处于高温解吸状态会加速萃取纤维失效时间，缩短寿命。如图5所示，不同解吸时间所得挥发性物质的总峰面积和数量存在显著性差异，吸附量和种类随解吸时间的延长而增加，解吸时间延长至8 min和10 min时，吸附量及种类变化无显著性差异，因此，选择8 min作为最佳解吸时间。

2.2 开花阶段枣花挥发性成分的GC-MS-O分析

表1 开花阶段枣花香气GC-MS-O分析结果Table 1 Results of GC-MS-O analysis of aroma components of jujube fl owers at different maturity stages

续表1

对3 个花期（花蕾期、盛花期、末花期）的枣花香气成分进行分析、鉴定与比较，主要挥发性化学物的鉴定结果见表1和图6。其中花蕾期的枣花还未开放，盛花期枣花中蜜盘呈嫩黄色，富含新鲜花蜜，末花期枣花中蜜盘呈淡绿色，花蜜量少或几乎不含蜜。采用顶空SPME结合GC-MS-O对3 个不同花期的枣花挥发性成分鉴定，如表1所示。花蕾期检测出59 种成分，其中包括酯类22 种、烯烃类19 种、醇类7 种、酸类5 种、酮类物质2 种，这59 种挥发性物质中经GC-O鉴定出38 种香气活性成分，α-罗勒烯、2-甲基丁酸乙酯、异戊酸乙酯、3-己烯醇乙酯、（E）-2-甲基-2-丁烯酸乙酯、4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、α-法尼烯为构成花蕾香气的主要成分。盛花期的枣花中共鉴定出59 种挥发性成分，包括酯类24 种、烯烃类13 种、醇类6 种、酸类4 种、醚类物质3 种、酮类5 种，这59 种挥发性物质中经GC-O鉴定出30 种香气活性成分，4-甲基-戊酸乙酯、苯甲酸乙酯、α-罗勒烯、2-甲基丁酸乙酯、4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、α-法尼烯为构成盛花期枣花香气的主要成分。末花期检测出55 种成分，其中包括酯类16 种、烯烃类13 种、醇类4 种、酸类8 种、醚类3 种、酮类4 种，这55 种挥发性成分中经GC-O鉴定出26 种香气活性成分，2-甲基丁酸乙酯、4-甲基-戊酸乙酯、月桂酸甲酯、α-罗勒烯、4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、α-法尼烯、2-甲基-环丁酮为构成末花期枣花香气的主要成分。

构成枣花挥发性成分的物质中酯类物质种类最多，是枣花香气的主要来源。多数酯类物质可以赋予植物果香味，2-甲基丁酸乙酯是枣花主要的酯类成分，有类似于草莓、青草、苹果的气味。酯类物质在枣花盛花期最多，末花期逐渐减少，与末花期相比，盛花期特有的酯类成分为（E）-2-甲基-2-丁烯酸乙酯、丁酸乙酯、（Z）-4-辛烯酸乙酯、十一酸乙酯、苯甲酸甲酯、水杨酸乙酯、十三烷酸乙酯、丁位癸内酯、棕榈酸乙酯，其中丁酸乙酯、（E）-2-甲基-2-丁烯酸乙酯具有果香味，末花期中这些酯类物质消失，这也是末花期枣花失香的原因之一。相对于其他2 个时期，花蕾期特有的酯类成分是异戊酸乙酯、（Z）-3-甲基丁酸-3-己烯酯、2-丁烯酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、3-甲基丁酸己酯、辛酸乙酯、水杨酸甲酯、（Z）-肉桂酸乙酯，其中异戊酸乙酯、辛酸乙酯、水杨酸甲酯具有果香或花香味，2-丁烯酸乙酯具有微酸味，这是造成枣花蕾与成花香气成分差异的原因之一。

烯烃类物质中（4E,6Z）-2,6-二甲基-2,4,6-辛三烯、α-罗勒烯、α-法尼烯、4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯为主要成分，α-罗勒烯与α-法尼烯具有花香气味，4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯具有清香味，是构成枣花香味的主要物质，α-罗勒烯和α-法尼烯从花蕾期到末花期相对含量逐渐升高，α-罗勒烯也是影响玉簪花香气的主要成分[23]。2,6-二甲基-1,3,5,7-辛四烯、月桂烯、2,4-二甲基苯乙烯、β-可巴烯、毕澄茄烯、柠檬烯只存在于花蕾中。

醇类物质也是香气的来源之一，（E）-3-己烯-1-醇在花蕾中相对含量较高，盛花期较低，但到了末花期未检出，具有典型青草味、酸味，也是板栗花的主要香气成分[24]；叶醇也存在于花蕾期和盛花期，具有酸味，末花期叶醇未检出；芳樟醇与橙花叔醇仅存在于花蕾中，橙花叔醇也存在于丁香花中，芳樟醇具有花香味[25-26]。

酸类物质在末花期时相对含量均有所增加，如正辛酸、肉豆蔻酸、棕榈酸是末花期枣花独有的挥发性成分，肉豆蔻酸可作为增香剂，酸类物质释放特殊的酸味或者青草味，在枣花中乙酸、4-甲基-3-戊烯酸、正己酸和壬酸具有典型的酸味或青草气味。

醚类物质主要存在于盛花期和花末期的枣花中，有苯甲醚、2-甲基苯甲醚、对甲苯甲醚。苯甲醚和2-甲基苯甲醚具有花香味，对甲苯甲醚具有清香味。醚类物质只存在于开放后的枣花中，说明醚类物质只在开花后释放，苯甲醚可用于香料的合成，也存在于天然山茶花精油中[27-28]。酮类物质在花蕾中较少，而在盛花期枣花中种类较多。酮类物质也是典型的芳香性成分[29]，枣花中典型的有2-甲基-环丁酮与邻氨基苯乙酮，2-甲基-环丁酮在末花期相对含量明显增加，具有较淡的花香味，邻氨基苯乙酮只存在于盛花期的枣花中。

图6 枣花不同开花阶段香气成分总离子流图Fig. 6 Total ion current chromatograms of jujube fl owers at different maturity stages

2.3 枣花蜜挥发性成分的GC-MS-O分析

表2 枣花蜜香气成分GC-MS-O分析结果Table 2 Results of GC-MS-O analysis of aroma components of jujube honey

续表2

如表2所示，枣花蜜中共检测到65 种挥发性成分，其中包括醇类14 种、酸类12 种、醛类10 种、烷烃7 种、酮类5 种、萜烯类4 种、酚类4 种、酯类2 种，这65 种挥发性物质中经GC-O鉴定出27 种香气活性成分，3,7-二甲基-1,5,7-辛三醇、壬醛、苯乙醛、芳樟醇、2,6-二甲基-3,7-辛二烯-2,6-二醇为构成枣花蜜香气的主要成分。壬醛、苯乙醛、芳樟醇在裴高璞[30]、孙雨安[31]等研究中也被鉴定为枣花蜂蜜的特征香气成分。

蜂蜜是花蜜经蜜蜂采集后贮存于蜂巢中，经过充分酿造而成的，不仅具有特有的酿造风味，还具有特殊的花香味，醇类、醛类、酸类物质为构成枣花蜂蜜香气的主要成分，占总挥发性成分的85.67%，与申永波等[32]检测结果一致。而枣花中酯类物质与烯烃类物质较多，以盛花期枣花为例，酯类与烯烃类物质占总挥发性成分的90.53%。枣花蜜中仅检测到2 种酯类物质，且相对含量较低。酯类与烯烃类物质仅占6.6%，说明枣花香气中的特征酯类成分并不是枣花蜜中的特征香气成分。醛类物质在枣花蜜中占29.64%，但并未在枣花中检测到，同时枣花蜜中醇类物质种类远多于枣花中的醇类物质，说明醛类及醇类可能是在蜂蜜酿造过程中产生的一类物质，赋予蜂蜜酿造风味。

2.4 枣花及枣花蜜香气成分分析

如表3所示，选择枣花的共有成分时，因为枣花的3 个不同开花期的香味物质有所变化，所以选择含有较高香味成分的花期。共有成分有月桂酸、芳樟醇、（E）-3-己烯-1-醇、肉豆蔻酸、异辛醇、乙酸、正己酸、正辛酸、壬酸、棕榈酸、2,6-二甲基-1,3,5,7-辛四烯、苯酚、水杨酸甲酯、甲氧基苯基-肟、萘、3-氰基吡啶、苯甲醇，这些共有成分相对含量差异较大。芳樟醇和壬酸是枣花蜜中相对含量较高的2 种物质，而其他成分不管在枣花还是枣花蜜中相对含量都不高。其中2,6-二甲基-1,3,5,7-辛四烯、（E）-3-己烯-1-醇、壬酸具有青草气味，芳樟醇、苯甲醇、月桂酸、水杨酸甲酯、萘具有花香味及清香味，乙酸、正己酸具有典型的酸味。这些共有成分是枣花蜜具有浓郁枣花香气的主要原因。

表3 枣花及枣花蜜共有香气成分及相对含量Table 3 Aroma components and their relative contents detected in both jujube fl owers and honey

3 结 论

对枣花香气成分的萃取采用顶空SPME法，枣花香气最佳萃取条件：50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头、样品添加量3 g、萃取温度40 ℃、萃取时间50 min。在此条件下将萃取纤维在进样口解吸8 min。采用GC-MS-O法对不同花期阶段的枣花进行鉴定和分析，共检测出84 种成分，其中38 种经GC-O闻香后鉴定为香气活性成分。异戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、（E）-2-甲基-2-丁烯酸乙酯、3-己烯醇乙酯、α-罗勒烯、4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、α-法尼烯为构成花蕾香气的主要成分。2-甲基丁酸乙酯、4-甲基-戊酸乙酯、α-罗勒烯、4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、α-法尼烯、苯甲酸乙酯为构成盛花期枣花香气的主要成分。2-甲基丁酸乙酯、4-甲基-戊酸乙酯、α-罗勒烯、4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、α-法尼烯、月桂酸甲酯、2-甲基-环丁酮为构成末花期枣花香气的主要成分。枣花蜜中共检测到65 种挥发性成分，其中27 种经GC-O闻香后鉴定为香气活性成分。3,7-二甲基-1,5,7-辛三醇、壬醛、苯乙醛、2,6-二甲基-3,7-辛二烯-2,6-二醇、芳樟醇为构成枣花蜜香气的主要成分。枣花与枣花蜜共有的香气成分为（E）-3-己烯-1-醇、异辛醇、芳樟醇、苯甲醇、乙酸、正己酸、正辛酸、壬酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、2,6-二甲基-1,3,5,7-辛四烯、苯酚、水杨酸甲酯、甲氧基苯基-肟、萘、3-氰基吡啶。以上共有成分是枣花蜜具有浓郁枣花香气的主要原因。